[發明專利]一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110101793.6
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN113005092A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 廖興華;王君;張慧敏;項園;李佳蓬;李慧;張同存
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/85;C12N15/62
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 李杰梅

1.一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，構建PD1基因sgRNA質粒pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR細胞質粒LMP1-CARPiggyBac Transposon，將pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR PiggyBac Transposon質粒與電轉緩沖液混合，制得電轉混合液，并用電轉混合液轉染PBMC細胞，得到轉染后的PBMC細胞；

S2，將轉染后的PBMC細胞轉入T細胞培養基，用磁珠激活CD3陽性T細胞，并培養擴增轉染后的PBMC細胞，獲得敲除PD1的LMP1-CAR-T細胞。

2.如權利要求1所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA質粒的PD1基因序列選自5'-GGN(19)GG、5'-GN(20)GG和5'-N(21)GG中的一種。

3.如權利要求2所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA質粒的構建方法為：

S1，在PD1基因的sgRNA核苷酸鏈序列的5'加上CCGG，合成正向寡核苷酸，對應互補鏈序列的5'加上CACG，合成反向寡核苷酸；

S2，將合成的1對互補的sgRNA寡聚核苷酸成對變性、退火后，形成可連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸；

S3，將退火的sgRNA寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得pGL3-U6-hPD1-sgRNA質粒。

4.如權利要求1所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述LMP1-CARPiggyBac Transposon質粒的構建方法為：

S1，依次連接抗LMP1單鏈抗體的輕鏈、抗LMP1單鏈抗體的重鏈、CD8α鉸鏈區、CD28跨膜區和胞內區、4-1BB胞內區和CD3ζ胞內區，并合成基因序列片段；

S2，將基因序列片段插入到Piggybac轉座子載體中，并用柱離心法提取質粒，得到能表達LMP1靶點CAR-T的質粒LMP1-CARPiggyBac Transposon。

5.如權利要求4所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，步驟S1所述抗LMP1單鏈抗體的輕鏈前還包括信號肽，抗LMP1單鏈抗體的輕鏈和抗LMP1單鏈抗體的重鏈之間還包括輕重鏈間隔區。

6.如權利要求1所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述磁珠為偶聯有CD3/CD28抗體的磁珠。

7.如權利要求1所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，所述PBMC細胞制備方法如下：

S1，采集外周血，用PBS稀釋抗凝血后加入裝有淋巴細胞分離液的離心管中慢升慢降離心；

S2，吸取離心后的白膜層轉入離心管，加入PBS，慢升慢降離心，棄上清，保留沉淀，重復加入PBS和離心步驟2次，即得PBMC細胞。

8.如權利要求1所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，將pGL3-U6-hPD1-sgRNA質粒、pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF質粒、LMP1-CAR PiggyBacTransposon質粒和Super PiggyBac Transposase質粒與T細胞核轉染試劑盒中的電轉緩沖液混合，獲得包含該四種質粒的電轉混合液，用該電轉混合液懸起1-2×107個PBMC細胞進行電轉。

9.如權利要求1所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，步驟S2所述T細胞培養基為含10％FBS的RPMI-1640培養基。

10.如權利要求1-9任一所述的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞在制備EVB淋巴瘤診斷試劑或治療藥物中的應用。