[發明專利]一種鑒定番茄頸腐基腐病抗性基因Frl檢測的方法

在審

• 申請號: 202110100363.2
• 申請日: 2021-03-09
• 公開（公告）號: CN112725502A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 金鳳媚;薛俊;孫海波;郝志愚
• 申請（專利權）人: 天津市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明公開了一種鑒定番茄頸腐基腐病抗性基因Frl檢測的方法。它是采用一組特異性引物對番茄頸腐基腐病抗性基因進行鑒定。該方法利用HRM開發出一種操作簡單的分子標記方法來檢測番茄頸腐根腐病的抗性基因。該方法不需酶切和電泳，只需利用HRM曲線就可區分出番茄頸腐根腐病抗感性。本方法可加快抗病育種進程，對推進蔬菜產業可持續發展具有重要意義。

技術領域

本發明提供一種快速、簡捷、高效的番茄頸腐基腐病抗性基因的方法，屬植物保護領域。

背景技術

近年來隨著設施番茄栽培面積的不斷擴大、頻繁引進國外品種及主栽品種的更換，使得番茄頸腐基腐病在一些番茄種植基地流行為害逐年偏重。目前在生產上推廣的很多番茄品種都表現出對番茄頸腐基腐病（Fusarium crown and root rot，FCRR）的高度感病性，且感病后發病速度快，死苗率非常高，給農戶造成嚴重的經濟損失。因此，積極開展番茄頸腐基腐病抗性鑒定工作和抗病育種研究工作，對減少該病害具有重要意義。

番茄頸腐基腐病是一種極具為害的土傳病害，由尖孢鐮刀菌FORL（Fusarium oxysporum f. sp. Radicis-lycopersici）引起。番茄頸腐基腐病抗源來自于野生番茄Solanum peruvianum(PI126944、PI128650、PI126926)，現已將抗病基因轉入栽培番茄中。有研究表明，番茄頸腐基腐病抗性遺傳受顯性單基因Frl控制，且該基因位于9號染色體的長臂上。

前人已經對番茄頸腐基腐病的抗性遺傳規律及分子標記進行了一些研究。Fazio等（1999)利用RAPD技術開發了一個抗番茄頸腐根腐病的標記UBC 194。然而，Tanyolac(2010)的研究結果則表明UBC 194不能準確地標記Frl基因的存在，并且表明RAPD技術區分不出雜合型和純合型，該技術在育種中的應用存在局限性。

Staniaszek（2014）等人以保守序列位點C2-At2的8025為基礎開發了一個CAPS標記，該標記與Frl緊密連鎖，同時研究表明該序列位于番茄9號染色體45cM的位置上。目前番茄的抗頸腐基腐病的育種中大多應用的是該CAPS標記。但在操作的過程中，CAPS標記需要先進行PCR擴增及電泳再進行酶切。該方法成本高，過程繁瑣，難以實現高通量檢測。

本研究就是在Staniaszek等人的CAPS標記基礎上，利用HRM方法開發出一種操作簡單的分子標記方法來檢測番茄頸腐基腐病的抗性基因（Frl）。該方法不需要電泳和酶切，只需利用HRM曲線就可檢測出番茄中是否存在Frl基因。本方法可加快抗病育種進程，對推進蔬菜產業可持續發展具有重要意義。

發明內容

目前在番茄頸腐根腐病的抗性基因（Frl）檢測方法中，需要進行電泳和限制性內切酶酶切等步驟。針對該方法檢測時間太長且過程繁瑣，難以實現高通量檢測等問題，發明人進行了大量的研究工作，通過基因克隆和測序確定了抗感品種中的基因差異，利用HRM方法建立了番茄頸腐基腐病的抗性基因的檢測體系。此方法無電泳和酶切，操作簡單是一種簡單方便的番茄頸腐基腐病的抗性基因（Frl）檢測的新方法。

本發明旨在提供一種簡便的抗性基因檢測方法，通過該方法能科學高效準確地檢測出番茄頸腐基腐病的抗性基因，為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容：

一種鑒定番茄頸腐基腐病抗性基因的特異性引物，特異性引物如下：

HRMC2F4: GGTACAGTATCAGTATGTCATCC

HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC。

本發明進一步公開了采用特異性引物進行番茄頸腐基腐病抗性基因（Frl）鑒定的方法，其特征在于按如下步驟進行：

（1）材料：待檢測的番茄種子

（2）方法

1）育苗將番茄種子播于育苗盤中每穴2粒，常規管理，待到2片真葉時進行檢測；