[發(fā)明專利]基于游離RNA檢測PD-L1表達量的方法及其試劑盒

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• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112725418A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 陳建國;陳川;張瑜巨
• 申請（專利權）人: 深圳樂土生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 周建軍;郭燕

一種基于游離RNA檢測PD?L1表達量的方法及其試劑盒，該方法包括：逆轉錄步驟，包括將待測的游離RNA樣本逆轉錄為cDNA；實時熒光定量PCR檢測步驟，包括對cDNA中的PD?L1基因、內參基因進行實時熒光定量PCR檢測，根據(jù)PD?L1基因、內參基因的Ct值預測待測樣本所屬個體的PD?L1表達量的強弱程度。本發(fā)明作為針對無法或者難以進行組織免疫組化檢測PD?L1的患者，在使用免疫治療方案前進行的療效評估手段，提高患者在免疫治療中的收益。

技術領域

本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于游離RNA檢測PD-L1表達量的方法及其試劑盒。

背景技術

癌癥是全世界范圍內影響人類健康和生命的重要因素，大多數(shù)癌癥患者在確診時已處于晚期，失去了手術機會且對放化療等保守治療方式不敏感，因此預后普遍偏差。隨著免疫腫瘤學的不斷發(fā)展，腫瘤的免疫治療成為了繼分子靶向治療之后的新熱點，其中PD-1/PD-L1信號途徑為近年來免疫治療的研究熱點之一，目前也有數(shù)款針對這一信號途徑的藥物上市，用于黑色素瘤、肺癌、結直腸癌等癌癥的治療。但PD-1/PD-L1免疫治療并非對每一個患者都有效，臨床實驗結果表明，僅有不到30％的患者能夠從PD-1/PD-L1免疫治療中獲益，加之治療費用高，且治療周期長，若治療無效，患者將喪失及時接受其他治療方法的時機，更重要的是，免疫治療引起的不良反應也不容忽視。因此，在選擇免疫治療方案前進行相應的檢測以預測其療效是非常有必要的。在基于PD-L1的免疫治療，PD-1/PD-L1抑制劑的療效和PD-L1的表達水平密切相關。

目前檢測PD-L1的表達水平，主要使用免疫組化的方法。具體來說，是利用特異性抗體(如28-8、22C3、SP263、SP142)，通過雜交顯色的方式來檢測癌癥組織標本中的PD-L1的表達水平。但是對于部分不能或很難獲得腫瘤組織的患者，PD-L1的評估就變得十分困難。另外，目前的免疫組化方法也面臨一些問題，例如在檢測技術方面，不同的檢測抗體、平臺以及不同閾值的設定對檢測結果會有不同的影響，在生物學方面，由于腫瘤內和腫瘤間異質性，檢測結果可能無法真實反映PD-L1的表達水平；組織來源方面，對于細胞學標本、存檔標本和新鮮標本，原發(fā)部位和轉移灶中PD-L1表達水平會有差異。除此之外，目前還有通過NGS大panel檢測ctDNA中腫瘤突變負荷(TMB)的方法評估免疫治療的療效，但是該方法檢測流程復雜、成本較高，對于很多患者來說是較重的經濟負擔。

發(fā)明內容

根據(jù)第一方面，一種實施例中提供一種基于游離RNA檢測PD-L1表達量的方法，包括：

逆轉錄步驟，包括將待測的游離RNA樣本逆轉錄為cDNA；

實時熒光定量PCR檢測步驟，包括對cDNA中的PD-L1基因、內參基因進行實時熒光定量PCR檢測，根據(jù)PD-L1基因、內參基因的Ct值預測待測樣本所屬個體的PD-L1表達量的強弱程度。

根據(jù)第二方面，一種實施例中提供一種用于實時熒光定量PCR檢測PD-L1基因的探針引物組合，所述探針包括如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，所述引物包括但不限于如下核苷酸序列組合中的至少一種：

1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

2)如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列。

根據(jù)第三方面，一種實施例中提供一種用于實時熒光定量PCR檢測PD-L1基因、內參基因的探針引物組合，用于實時熒光定量PCR檢測PD-L1基因的探針包括如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，引物包括但不限于如下核苷酸序列組合中的至少一種：

1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

2)如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列；