[發明專利]基于游離RNA檢測PD-L1表達量的方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202110099183.7
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112725418A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 陳建國;陳川;張瑜巨
• 申請（專利權）人: 深圳樂土生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 周建軍;郭燕

1.一種基于游離RNA檢測PD-L1表達量的方法，其特征在于，包括：

逆轉錄步驟，包括將待測的游離RNA樣本逆轉錄為cDNA；

實時熒光定量PCR檢測步驟，包括對cDNA中的PD-L1基因、內參基因進行實時熒光定量PCR檢測，根據PD-L1基因、內參基因的Ct值預測待測樣本所屬個體的PD-L1表達量的強弱程度。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括：將待測的游離RNA樣本、用于對PD-L1基因進行實時熒光定量PCR檢測的探針引物組合、用于對內參基因進行實時熒光定量PCR檢測的探針引物組合加入一步法逆轉錄-實時熒光定量PCR反應體系中，依次進行逆轉錄、實時熒光定量PCR檢測，根據PD-L1基因、內參基因的Ct值預測待測樣本所屬個體的PD-L1表達量的強弱程度；

和/或，根據PD-L1基因、內參基因的Ct值差值的絕對值預測待測樣本所屬個體的PD-L1表達量的強弱程度。

3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，根據PD-L1基因、內參基因的Ct值預測待測樣本所屬個體的PD-L1表達量的強弱程度的方法如下：

所述PD-L1基因與內參基因的Ct差值的絕對值≥第一閾值時，則預測為PD-L1弱表達；

第二閾值≤所述PD-L1基因與內參基因的Ct差值的絕對值＜第一閾值時，則預測為PD-L1中表達；

所述PD-L1基因與內參基因的Ct差值的絕對值＜第二閾值時，則預測為PD-L1強表達。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一閾值為15；

和/或，所述第二閾值為10。

5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于對PD-L1基因進行實時熒光定量PCR檢測的探針包括如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；

和/或，用于對PD-L1基因進行實時熒光定量PCR檢測的引物選自如下核苷酸序列組合中的至少一種：

1)如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

2)如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列；

和/或，所述內參基因選自β-Actin、GAPDH、U6、HMBS、B2M、TUBB、SDHA、18S rRNA、ACTB、RPL4、PPIA、HPRT1、YWHAZ、RPP30、ERG中的至少一種；

和/或，所述內參基因選自β-Actin，用于對內參基因進行實時熒光定量PCR檢測的的探針包括如SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；

和/或，所述內參基因選自β-Actin，用于對內參基因進行實時熒光定量PCR檢測的引物選自如下核苷酸序列組合中的至少一種：

1)如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；

2)如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示核苷酸序列；

和/或，實時熒光定量PCR反應的循環數為40-50，循環反應時收集熒光；

和/或，實時熒光定量PCR反應時，每個循環反應如下：94-98℃，10-20s；56-62℃，15-35s；

和/或，實時熒光定量PCR反應時，循環反應之前的程序依次如下：40-45℃，94-98min；94-98℃，1-5min；

和/或，用于對PD-L1基因進行實時熒光定量PCR檢測的探針的5’端修飾有第一標記分子，3’端修飾有第二標記分子；用于對內參基因進行實時熒光定量PCR檢測的探針的5’端修飾有第三標記分子，3’端修飾有第四標記分子；所述第一標記分子、第二標記分子物理靠近時會發生熒光能量共振轉移，所述第三標記分子、第四標記分子物理靠近時會發生熒光能量共振轉移；

和/或，所述第一標記分子、所述第三標記分子為熒光報告基團，所述第二標記分子、第四標記分子為熒光淬滅基團；

和/或，所述第一標記分子所發出的熒光波長不同于所述第三標記分子所發出的熒光波長；

和/或，所述熒光報告基團選自FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5中的至少一種；

和/或，所述第二標記分子、第四標記分子為相同或不同的熒光淬滅基團；

和/或，所述熒光淬滅基團選自BHQ1、BHQ2、MGB中的至少一種。