[發(fā)明專利]一種抗原特異性Treg及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110097235.7
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112941030B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李明謙;呂國悅;張鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N5/0783;C12N5/0784;A61K39/00;A61P37/02
• 代理公司: 北京專贏專利代理有限公司 11797
• 代理人: 李斌

1.一種抗原特異性Treg在制備用于誘導(dǎo)移植免疫耐受的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述抗原特異性Treg的制備方法包括以下步驟：

取受體外周血中的單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，移除培養(yǎng)基，去掉未貼壁細(xì)胞或分選出單核細(xì)胞，加入含有GM-CSF與IL-4的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到第一培養(yǎng)上清；

向第一培養(yǎng)上清中加入TGF-β1與IL-10進(jìn)行培養(yǎng)，得到第二培養(yǎng)上清；

向第二培養(yǎng)上清中加入tolDC細(xì)胞因子雞尾酒進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)tolDC成熟，得到受體tolDC；

提取供體外周血單個核細(xì)胞的全RNA，應(yīng)用供體MHC-I分子抗原cDNA的編碼區(qū)特異性引物對供體MHC-I分子抗原cDNA的編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；

將所得PCR產(chǎn)物連接到帶有T7啟動子的質(zhì)粒上，通過連接、轉(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后，再提取質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶通將質(zhì)粒線性化，獲得供體MHC-I分子?ivt-mRNA制備模板；

將供體MHC-I分子?ivt-mRNA制備模板，轉(zhuǎn)錄成具有5’端帽子結(jié)構(gòu)和3’端polyA結(jié)構(gòu)的供體MHC-I分子?ivt-mRNA，純化收集所得產(chǎn)物；

將ivt-mRNA轉(zhuǎn)染至上述受體tolDC中，獲得表達(dá)遞呈供體MHC-I分子抗原的受體tolDC；

將上述表達(dá)遞呈供體MHC-I分子抗原的受體tolDC，與受體nTreg細(xì)胞在含有IL-2的條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，以獲得供體MHC-I分子抗原特異性Treg；

其中，所述新鮮培養(yǎng)基中GM-CSF的濃度為80~120ng/mL，IL-4的濃度為15~25ng/mL；

所述第一培養(yǎng)上清中加入的TGF-β1的濃度為0.5~1.5ng/mL，加入的IL-10的濃度為15~25ng/mL；

所述tolDC細(xì)胞因子雞尾酒包括以下按照質(zhì)量濃度計的組分：GM-CSF?80~120ng/mL、IL-4?15~25ng/mL、TGF-β1?0.5~1.5ng/mL、IL-10?15~25ng/mL、IL-1β?8~12ng/mL、TNF-α?8~12ng/mL、PGE₂?230~270ng/mL、IL-6?10~20ng/mL；

所述供體MHC-I分子抗原cDNA的編碼區(qū)特異性引物包括核苷酸序列分別如序列表SEQID?NO:1~2所示的上、下游引物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟中，共培養(yǎng)的條件中，IL-2的濃度為200~1000U/mL。