[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)拉蒂諾病毒、莫巴拉病毒和莫佩亞病毒的引物探針、靶標(biāo)組合、試劑盒和方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110096385.6
• 申請(qǐng)日: 2021-01-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112662817B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李建東;杜珊珊;李阿茜;梁米芳;李德新;王世文;黃曉霞;李川;王芹;孫麗娜;蕪為
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 孫怡

本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了用于檢測(cè)拉蒂諾病毒、莫巴拉病毒和莫佩亞病毒的引物探針、靶標(biāo)組合、試劑盒和方法。本發(fā)明的用于分別或同時(shí)檢測(cè)拉蒂諾病毒、莫巴拉病毒和莫佩亞病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR檢測(cè)的引物探針組合，含有三對(duì)特異性引物和三條特異性探針，其中，所述特異性引物的序列如SEQ ID NO.1?6所示，所述特異性探針的序列如SEQ ID NO.7?9所示。采用所述引物探針組合進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，具有較高的特異性和靈敏性，可重復(fù)性好，檢測(cè)簡(jiǎn)便快速，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)拉蒂諾病毒、莫巴拉病毒和莫佩亞病毒的引物探針、靶標(biāo)組合、試劑盒和方法。

背景技術(shù)

沙粒病毒由外膜和核衣殼組成，呈圓形，含有脂質(zhì)(外)胞膜，直徑約為50-300nm(平均110-130nm)。外膜表面覆蓋有一種蛋白組成的、長(zhǎng)度約10nm的纖突，內(nèi)部可見(jiàn)不同數(shù)量的來(lái)自宿主細(xì)胞的核糖體，在電鏡下形如沙粒樣，沙粒病毒因此而得名。病毒基因組由雙向分節(jié)段的單股負(fù)義鏈RNA組成，較大的為L(zhǎng)片段，長(zhǎng)度約7400個(gè)核苷酸，編碼RNA依賴的RNA聚合酶L蛋白和具有轉(zhuǎn)錄復(fù)制調(diào)節(jié)功能的Z蛋白；較小的為S片段，長(zhǎng)度約3400個(gè)核苷酸，編碼核蛋白NP和糖蛋白GP。L和S片段在病毒粒子中并非等量，而是以2：1的摩爾比存在。每個(gè)片段上的基因分別被含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)隔開(kāi)，5’端無(wú)帽狀結(jié)構(gòu)，3’端序列保守。由于S片段較L片段更為保守，因此常用S片段進(jìn)行病毒進(jìn)化研究和分類(lèi)鑒定。

根據(jù)ICTV(國(guó)際病毒學(xué)分類(lèi)委員會(huì))2018年最新頒布病毒分類(lèi)(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)，沙粒病毒科分為4個(gè)屬：Antennavirus、Hartmanivirus、Mammarenavirus和Reptarenavirus，包含43個(gè)種。哺乳動(dòng)物沙粒病毒屬(Mammarenavirus)中35個(gè)種可分為舊世界沙粒病毒和新世界沙粒病毒，舊世界沙粒病毒中，代表病毒是淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒簡(jiǎn)稱LCMV病毒。新世界沙粒病毒主要包括有4個(gè)clade，clade A有Pirital，Pichinde，F(xiàn)lexal，Parana和Alloahuayo virus五種病毒；cladeB有Junin,Machupo,Guanarito,Amapari,Tacaribe,Sabia,Cupixi和Chapare viruses八種病毒；clade C有Oliveros和Latino兩種病毒；clade A/Rec包括有Whitewater Arroyo,Tamiami和Bear Canyo三種病毒；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示Lujo virus屬于新世界沙粒病毒，但不在四個(gè)clade中。目前，已發(fā)現(xiàn)對(duì)人致病的沙粒病毒主要有拉沙病毒(Lassa virus)引起拉沙熱，胡寧病毒(Junin virus)引起阿根廷出血熱，馬秋波病毒(Machupo virus)和查帕雷病毒(Chapare virus)引起玻利維亞出血熱，盧約病毒(Lujo virus)引起盧約出血熱，瓜納瑞托病毒(Guanarito virus)引起委內(nèi)瑞拉出血熱，薩比亞病毒(Sabid virus)引起巴西出血熱，淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)引起淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎。

拉蒂諾病毒于1973年在玻利維亞胼胝暮鼠(Calomys callosus)中首次被發(fā)現(xiàn)，該病毒主要局限于玻利維亞的嚙齒類(lèi)動(dòng)物中傳播；莫巴拉病毒于1983年在中非共和國(guó)柔毛鼠(Arvicanthis sp)首次被發(fā)現(xiàn)，該病毒主要局限于中非的嚙齒類(lèi)動(dòng)物中傳播；莫佩亞病毒于1977年在坦桑尼亞莫洛戈羅地區(qū)的多乳鼠(Mastomys natalensis)首次被發(fā)現(xiàn)。目前，該病毒主要局限于津巴布韋、莫桑比克地區(qū)的嚙齒類(lèi)動(dòng)物中傳播。

病毒病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要依靠于病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和病毒核酸檢測(cè)。病毒核酸檢測(cè)主要是基于PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR有著快速、高靈敏度和特異度的優(yōu)點(diǎn)，是目前運(yùn)用較多的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。該方法基于熒光共振能量遷移的原理，通過(guò)對(duì)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，將監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化繪制一條曲線。該方法全程閉管操作，降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)PCR產(chǎn)物除了可以進(jìn)行定性分析，也可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。