[發(fā)明專利]一株過表達(dá)Gis4的釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110096375.2
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112662576B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 應(yīng)漢杰;蔣穎;陳勇;梁偲策;張濤;朱家慶;趙偉;余斌
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/66;C12N15/31;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發(fā)明公開了一株過表達(dá)Gis4基因的釀酒酵母基因工程菌，該菌株由原始釀酒酵母的Gis4基因過表達(dá)后改造得到。由于原始菌株在固定化發(fā)酵中菌體聚集過多且聚集體不成熟，電阻較高，阻礙了傳質(zhì)傳導(dǎo)，導(dǎo)致其發(fā)酵周期的加長，而過表達(dá)Gis4基因的釀酒酵母基因工程菌對比原始釀酒酵母菌株在游離發(fā)酵中絮凝特性明顯減弱，在固定化發(fā)酵中細(xì)胞粘附聚集情況減少，黏附性降低，游離細(xì)胞增多，加強(qiáng)了傳質(zhì)傳導(dǎo)，縮短了發(fā)酵周期。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株過表達(dá)Gis4基因的釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

生物膜也稱為生物被膜，是一種由微生物細(xì)胞和其分泌的胞外基質(zhì)共同組成的生物聚集體，由微生物集群與其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜狀結(jié)構(gòu)附著于載體表面。生物膜的存在，不僅作為屏障為細(xì)胞的生命活動創(chuàng)造了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，介導(dǎo)了細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接，而且還承擔(dān)了物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息的跨膜傳遞和能量轉(zhuǎn)換等功能，更重要的是，生物膜還作為一種重要的工業(yè)應(yīng)用——固定化發(fā)酵。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，固定化發(fā)酵中所形成的生物膜能在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出較高的底物耐受性和較快的發(fā)酵效率。通常條件下，常規(guī)的游離細(xì)胞發(fā)酵50g葡萄糖大約需要8h左右，而固定化細(xì)胞只需要6h就可以將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，展現(xiàn)了固定化細(xì)胞出色的發(fā)酵效率和發(fā)酵能力。但生物膜過多，會造成菌體聚集過多且聚集體不成熟，電阻較高，阻礙了傳質(zhì)傳導(dǎo)，導(dǎo)致其發(fā)酵周期的加長。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有的釀酒酵母菌株在生物膜固定化發(fā)酵過程中生成的生物膜過多的問題，提供一株過表達(dá)Gis4基因的釀酒酵母基因工程菌，可定向減少細(xì)胞與載體的粘附性，加強(qiáng)傳質(zhì)傳導(dǎo)，提高發(fā)酵效率。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述釀酒酵母基因工程菌的應(yīng)用。

發(fā)明思路：有數(shù)據(jù)表明，Gis4抑制Snf1基因的表達(dá)，而Snf1調(diào)節(jié)Flo11基因的轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)lo11又是介導(dǎo)生物膜形成過程中細(xì)胞與介質(zhì)黏附的關(guān)鍵因子。。因此，本發(fā)明選取Gis4基因作為改造對象，構(gòu)建釀酒酵母基因工程菌，以定向減弱菌株在生物膜形成過程中細(xì)胞與載體的黏附能力，，進(jìn)而提高發(fā)酵效率和發(fā)酵能力。

為了解決上述第一個技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一株釀酒酵母基因工程菌，所述釀酒酵母的Gis4基因過表達(dá)。

其中，所述釀酒酵母為Saccharomyces?cerevisiae1308，來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC?1308，可商購得到。

其中，所述Gis4基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述的釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)以Saccharomyces?cerevisiae1308基因組DNA為模板，擴(kuò)增出Gis4目的基因片段；

(2)利用限制性內(nèi)切酶獲得線性化質(zhì)粒pYX212，將Gis4目的基因片段與線性化質(zhì)粒pYX212導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中，獲得DH5α-pYX212-Gis4菌株，提取所獲得的目標(biāo)大腸桿菌的質(zhì)粒；

(3)將步驟(2)得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)中，即得過表達(dá)釀酒酵母基因工程菌。

其中，步驟(2)中，所述限制性內(nèi)切酶為SacI。

步驟(2)中，用限制性核酸內(nèi)切酶對獲得質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，利用凝膠電泳對取得質(zhì)粒進(jìn)行可視化初篩。

步驟(1)中，擴(kuò)增Gis4基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。

步驟(1)中，所述Gis4基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。