[發明專利]用于阿馬帕里病毒、庫皮科斯病毒和伊派病毒檢測的引物探針組合、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 202110096371.4
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112662816B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 李建東;杜珊珊;李阿茜;梁米芳;李德新;王世文;黃曉霞;李川;王芹;孫麗娜;蕪為
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 商秀玲

1.用于阿馬帕里病毒、庫皮科斯病毒和伊派病毒檢測的引物探針組合，其特征在于，含有三對特異性引物和三條特異性探針，其中，所述特異性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述特異性探針的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

2.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述特異性探針分別標記產生不同熒光色的熒光基團，所述熒光基團包括熒光報告基團和熒光淬滅基團；

所述熒光報告基團為選自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX、LCRED640、LC RED705中的任一種；所述熒光淬滅基團為選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一種。

3.根據權利要求1或2所述的引物探針組合，其特征在于，序列如SEQ ID NO.7所示的特異性探針的5’端標記Texas Rad熒光報告基團，3’端標記BHQ2熒光淬滅基團；序列如SEQ IDNO.8所示的特異性探針的5’端標記HEX熒光報告基團，3’端標記BHQ2熒光淬滅基團；序列如SEQ ID NO.9所示的特異性探針的5’端標記FAM熒光報告基團，3’端標記BHQ1熒光淬滅基團。

4.權利要求1～3任一項所述的引物探針組合在制備用于檢測阿馬帕里病毒、庫皮科斯病毒和伊派病毒的試劑盒中的應用。

5.用于阿馬帕里病毒、庫皮科斯病毒和伊派病毒檢測的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1～3任一項所述的引物探針組合。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進行實時熒光定量RT-PCR檢測時的反應程序為：首先在50℃反應25-35min進行病毒基因組的逆轉錄；然后在95℃反應8-12min，再在95℃變性10-20s、60℃退火60-90s運行40個循環進行擴增檢測。

7.根據權利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒在進行實時熒光定量RT-PCR檢測時的反應體系中，上游引物、下游引物和探針的摩爾比為2:2:1。

8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒在進行實時熒光定量RT-PCR檢測時的25μL反應體系為：2×緩沖液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探針0.25μL，酶1μL，模板5μL，水補足至25μL。

9.一種利用實時熒光定量RT-PCR檢測阿馬帕里病毒、庫皮科斯病毒和伊派病毒的非疾病診斷目的的方法，其特征在于，以待測樣品的RNA為模板，利用如SEQ ID NO.1-6所示的特異性引物和如SEQ ID NO.7-9所示的特異性探針進行實時熒光定量RT-PCR，根據擴增曲線判斷待測樣品中是否含有阿馬帕里病毒、庫皮科斯病毒和伊派病毒。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量RT-PCR的反應程序為：首先在50℃反應25-35min進行病毒基因組的逆轉錄；然后在95℃反應8-12min，再在95℃變性10-20s、60℃退火60-90s運行40個循環進行擴增檢測；

和/或，所述實時熒光定量RT-PCR的反應體系中，上游引物、下游引物和探針的摩爾比為2:2:1。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量RT-PCR的25μL反應體系為：2×緩沖液12.5μL，10μM上游引物0.5μL,10μM下游引物0.5μL，10μM探針0.25μL，酶1μL，模板5μL，水補足至25μL。