[發明專利]一種鞘氨醇膠裂解酶及酶解鞘氨醇膠的制備方法

有效

• 申請號: 202110095605.3
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112680435B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 王繼乾;朱虎;李慧;李本超;徐海;姬思雪;常愛平;柳建林
• 申請（專利權）人: 中國石油大學（華東）;福建師范大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/70;C12N15/60;C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 高洋;牛繼梅

本發明公開了一種鞘氨醇膠裂解酶及酶解鞘氨醇膠的制備方法，屬于生物工程技術領域。本發明的鞘氨醇膠裂解酶是由含有pET28a?WelR重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)在添加IPTG的條件下，16?30℃誘導4?20小時獲得的；采用本發明的鞘氨醇膠裂解酶對鞘氨醇膠進行裂解克服了采用化學法制備不同分子量鞘氨醇膠過程中的耗能、分離困難、反應條件難以控制等缺陷。本發明方法制備的酶解鞘氨醇膠具備較好的羥基自由基清除活性，可用于食品、護膚品等領域，拓展了鞘氨醇膠的應用。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種鞘氨醇膠裂解酶及酶解鞘氨醇膠的制備方法。

背景技術

微生物代謝膠也叫生物合成膠，是微生物產生的具有保護作用的一種生物高聚物。近年來研究者發現了包括結冷膠(Gellan gum,S-60)、威蘭膠(Welan gum,S-130)、鼠李膠(Rhamsan gum,S-194)、迪特膠(Diutan gum,S-657)、S-88、S-198和NW-11在內的多種鞘氨醇膠。它們一般都具有相似的主鏈結構，即葡萄糖-葡萄糖醛酸-葡萄糖-X-(X是L-鼠李糖或L-甘露糖)，被統稱為鞘氨醇膠(Sphingans)。由于鞘氨醇膠多具有優良的流變學性質、熱穩定性、酸堿穩定性等性能，可廣泛應用于食品、混凝土、醫藥、石油等工農業生活的各個方面，已經引起越來越多的關注。鞘氨醇單胞菌WG(中國專利201410485635.5，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013161)可以生產一種新型鞘氨醇膠WL，該多糖具有優于黃原膠、威蘭膠的粘彈性、觸變性、耐溫性及耐鹽性，在石油開采領域具有重要的應用價值。

但是，由于鞘氨醇膠WL分子量較大，分離純化后難于重新溶解，限制了其應用，因此，需要對其進行降解，適度降低分子量。同時，鞘氨醇膠WL的流變學性能、耐溫耐鹽性及水溶性等性能均具有分子量依賴性，因此，制備不同分子量的鞘氨醇膠WL，可以獲得適用于不同領域的多糖樣品。目前，多糖降解多以化學降解方法為主，但化學降解條件要求較高，過程繁瑣，也會導致降解過程中產物分離困難，產物分子量分布范圍較寬等缺陷。采用生物酶解方法能夠克服這些困難。但是，因為鞘氨醇膠結構的特殊性，專一性降解鞘氨醇膠的生物酶較少，采用生物降解法降解鞘氨醇膠的研究較少，生物酶解法降解鞘氨醇單胞菌WG生產的鞘氨醇膠WL國內外還未曾有過報道。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種鞘氨醇膠裂解酶及酶解鞘氨醇膠的制備方法。采用本發明的鞘氨醇膠裂解酶對鞘氨醇膠進行裂解克服了采用化學法制備不同分子量鞘氨醇膠過程中的耗能、分離困難、反應條件難以控制等缺陷。本發明方法制備的酶解鞘氨醇膠具備較好的羥基自由基清除活性，可用于食品、護膚品等領域，拓展了鞘氨醇膠的應用。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種鞘氨醇膠裂解酶，由以下方法制備而成：

(1)將含有pET28a-WelR重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種到LB培養基中，37℃培養至OD₆₀₀至0.6～1.0，加入終濃度為0.2-5mM的IPTG進行誘導，在16-30℃下誘導4-20小時；

(2)將步驟(1)誘導表達后的菌液離心收集菌體，用去離子水清洗兩次，并重新懸浮在pH為7.4的PBS緩沖液中，冰水浴超聲破碎至菌體澄清，超聲破碎后進一步離心取上清即得到鞘氨醇膠裂解酶的粗酶液。

在上述方案的基礎上，所述pET28a-WelR重組質粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。

上述鞘氨醇膠裂解酶在鞘氨醇膠裂解中的應用。

在上述方案的基礎上，所述鞘氨醇膠由鞘氨醇單胞菌發酵產生。

在上述方案的基礎上，所述鞘氨醇單胞菌為鞘氨醇單胞菌WG，保藏號為CCTCC No:M2013161。