[發明專利]一種鞘氨醇膠裂解酶及酶解鞘氨醇膠的制備方法有效
| 申請號： | 202110095605.3 | 申請日： | 2021-01-25 |
| 公開（公告）號： | CN112680435B | 公開（公告）日： | 2022-03-25 |
| 發明（設計）人： | 王繼乾;朱虎;李慧;李本超;徐海;姬思雪;常愛平;柳建林 | 申請（專利權）人： | 中國石油大學（華東）;福建師范大學 |
| 主分類號： | C12N9/88 | 分類號： | C12N9/88;C12N15/70;C12N15/60;C12P19/04;C12R1/19 |
| 代理公司： | 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308 | 代理人： | 高洋;牛繼梅 |
| 地址： | 266580 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 鞘氨醇膠 裂解 酶解鞘氨醇膠 制備 方法 | ||
1.鞘氨醇膠裂解酶在鞘氨醇膠裂解中的應用，其特征在于，所述鞘氨醇膠裂解酶由以下方法制備而成：
(1)將含有pET28a-WelR重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種到LB培養基中，37℃培養至OD600至0.6～1.0，加入終濃度為0.2-5mM的IPTG進行誘導，在16-30℃下誘導4-20小時；
(2)將步驟(1)誘導表達后的菌液離心收集菌體，用去離子水清洗兩次，并重新懸浮在pH為7.4的PBS緩沖液中，冰水浴超聲破碎至菌體澄清，超聲破碎后進一步離心取上清即得到鞘氨醇膠裂解酶的粗酶液；
其中，所述pET28a-WelR重組質粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述鞘氨醇膠由鞘氨醇單胞菌發酵產生。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述鞘氨醇單胞菌為鞘氨醇單胞菌WG，保藏號為CCTCC No:M2013161。
4.一種酶解鞘氨醇膠的制備方法，其特征在于，采用鞘氨醇膠裂解酶進行酶解；
所述鞘氨醇膠裂解酶由以下方法制備而成：
(1)將含有pET28a-WelR重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種到LB培養基中，37℃培養至OD600至0.6～1.0，加入終濃度為0.2-5mM的IPTG進行誘導，在16-30℃下誘導4-20小時；
(2)將步驟(1)誘導表達后的菌液離心收集菌體，用去離子水清洗兩次，并重新懸浮在pH為7.4的PBS緩沖液中，冰水浴超聲破碎至菌體澄清，超聲破碎后進一步離心取上清即得到鞘氨醇膠裂解酶的粗酶液；
其中，所述pET28a-WelR重組質粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根據權利要求4所述酶解鞘氨醇膠的制備方法，其特征在于，所述鞘氨醇膠裂解酶的用量為每mg鞘氨醇膠2-10μL，酶解時間為10-180min。
6.根據權利要求5所述酶解鞘氨醇膠的制備方法，其特征在于，步驟如下：
(1)將鞘氨醇膠溶于pH為7.4的PBS緩沖液中，攪拌過夜，使其充分溶解，配制鞘氨醇膠溶液；
(2)將步驟(1)制備的鞘氨醇膠溶液與鞘氨醇膠裂解酶的粗酶液同時升溫至30℃；并將預熱后的粗酶液加入預熱后的鞘氨醇膠溶液中進行酶解反應，粗酶液的使用量為2-10μL/mg底物；酶解反應溫度為30℃，轉速150r/min，pH為7.4，反應時間為10-180min；
(3)將步驟(2)酶解后的混合液升溫至100℃，煮沸10min，使酶滅活，待冷卻至室溫；
(4)將步驟(3)滅酶后的反應液于8000r/min離心15min，除去蛋白沉淀，用截留分子量為8000～14000Da的透析袋進行透析，除去鹽離子以及雜質，進行冷凍干燥，獲得不同分子量的鞘氨醇膠WL樣品。
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