[發(fā)明專利]一種鞘氨醇膠裂解酶及酶解鞘氨醇膠的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110095605.3
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112680435B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王繼乾;朱虎;李慧;李本超;徐海;姬思雪;常愛平;柳建林
• 申請（專利權(quán)）人: 中國石油大學(xué)（華東）;福建師范大學(xué)
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/70;C12N15/60;C12P19/04;C12R1/19
• 代理公司: 山東三邦知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37308
• 代理人: 高洋;牛繼梅

1.鞘氨醇膠裂解酶在鞘氨醇膠裂解中的應(yīng)用，其特征在于，所述鞘氨醇膠裂解酶由以下方法制備而成：

(1)將含有pET28a-WelR重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種到LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀至0.6～1.0，加入終濃度為0.2-5mM的IPTG進行誘導(dǎo)，在16-30℃下誘導(dǎo)4-20小時；

(2)將步驟(1)誘導(dǎo)表達后的菌液離心收集菌體，用去離子水清洗兩次，并重新懸浮在pH為7.4的PBS緩沖液中，冰水浴超聲破碎至菌體澄清，超聲破碎后進一步離心取上清即得到鞘氨醇膠裂解酶的粗酶液；

其中，所述pET28a-WelR重組質(zhì)粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鞘氨醇膠由鞘氨醇單胞菌發(fā)酵產(chǎn)生。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鞘氨醇單胞菌為鞘氨醇單胞菌WG，保藏號為CCTCC No:M2013161。

4.一種酶解鞘氨醇膠的制備方法，其特征在于，采用鞘氨醇膠裂解酶進行酶解；

所述鞘氨醇膠裂解酶由以下方法制備而成：

(1)將含有pET28a-WelR重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種到LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀至0.6～1.0，加入終濃度為0.2-5mM的IPTG進行誘導(dǎo)，在16-30℃下誘導(dǎo)4-20小時；

(2)將步驟(1)誘導(dǎo)表達后的菌液離心收集菌體，用去離子水清洗兩次，并重新懸浮在pH為7.4的PBS緩沖液中，冰水浴超聲破碎至菌體澄清，超聲破碎后進一步離心取上清即得到鞘氨醇膠裂解酶的粗酶液；

其中，所述pET28a-WelR重組質(zhì)粒中，WelR基因序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述酶解鞘氨醇膠的制備方法，其特征在于，所述鞘氨醇膠裂解酶的用量為每mg鞘氨醇膠2-10μL，酶解時間為10-180min。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述酶解鞘氨醇膠的制備方法，其特征在于，步驟如下：

(1)將鞘氨醇膠溶于pH為7.4的PBS緩沖液中，攪拌過夜，使其充分溶解，配制鞘氨醇膠溶液；

(2)將步驟(1)制備的鞘氨醇膠溶液與鞘氨醇膠裂解酶的粗酶液同時升溫至30℃；并將預(yù)熱后的粗酶液加入預(yù)熱后的鞘氨醇膠溶液中進行酶解反應(yīng)，粗酶液的使用量為2-10μL/mg底物；酶解反應(yīng)溫度為30℃，轉(zhuǎn)速150r/min，pH為7.4，反應(yīng)時間為10-180min；

(3)將步驟(2)酶解后的混合液升溫至100℃，煮沸10min，使酶滅活，待冷卻至室溫；

(4)將步驟(3)滅酶后的反應(yīng)液于8000r/min離心15min，除去蛋白沉淀，用截留分子量為8000～14000Da的透析袋進行透析，除去鹽離子以及雜質(zhì)，進行冷凍干燥，獲得不同分子量的鞘氨醇膠WL樣品。