[發明專利]小鼠肺類器官培養方法

有效

• 申請號: 202110095493.1
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112852709B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 周宏;孔輝;解衛平;曾曉寧;黃文;劉萍
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 葛勝非

1.一種小鼠肺類器官培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）收集50-80μm的小鼠肺球體，離心棄上清后，加入DMEM/F12培養基重懸肺球體，離心棄上清；

（2）重復步驟（1）1-2次；

（3）根據肺球體數量加入基質膠；所述基質膠選用Matrigel基底膜基質膠；基質膠的用量為每200-300個肺球體/50μL基質膠；

（4）孵育肺球體和Matrigel基底膜基質膠的混合物使基質膠固化；

（5）加入肺類器官培養基，轉移至二氧化碳細胞培養箱進行培養；

其中，所述肺球體為小鼠肺組織原代上皮干細胞球，其制備方式如下：

a. 取小鼠肺葉組織塊，置于預熱的膠原酶消化溶液中消化；

b. 加入等量的含FBS的DMEM/F12培養基終止消化，吹打混勻后細胞篩過濾；過濾液離心后棄除上清；

c. 加入紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，室溫孵育后加入DMEM/F12培養基混勻，離心后棄除上清；

d. 重復步驟c直至細胞沉淀變白；

e. 加入DNA酶溶液重懸細胞沉淀，加入DMEM/F12培養基混勻，離心后棄除上清；

f. 加入DMEM/F12培養基重懸細胞沉淀，吹打混勻，細胞篩過濾，離心后棄除上清；

g. 加入肺球體培養基重懸，調整細胞密度后懸浮培養；

所述肺球體培養基為含1×B-27添加劑，1×青霉素/鏈霉素溶液， 4 μg/mL肝素， 20ng/mL EGF， 10 ng/mL FGF2， 10 μM Y-27632的DMEM/F12培養基，所述B-27添加劑中不含維生素A；

所述肺類器官培養基為含0.48 μg/mL 氫化可的松溶液、100 U/mL 青霉素溶液、100 μg/mL 鏈霉素溶液、4 μg/mL 肝素、20 ng/mL EGF的PneumaCult^TM-ALI培養基。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，離心條件為：200-300g，5-10分鐘。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，添加基質膠時，使用預冷的移液槍頭充分混勻。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）中，采用多孔板進行孵育。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，37℃下孵育30-45分鐘使基質膠固化。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，類器官培養過程中，每兩天更換肺類器官培養基。