[發(fā)明專利]小鼠肺類器官培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110095493.1
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN112852709B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周宏;孔輝;解衛(wèi)平;曾曉寧;黃文;劉萍
• 申請（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 葛勝非

本發(fā)明公開了一種小鼠肺類器官培養(yǎng)方法，采用50?80μm的小鼠肺組織原代上皮干細胞球用于小鼠肺類器官培養(yǎng)，根據(jù)肺球體數(shù)量加入基質(zhì)膠，孵育肺球體和Matrigel基底膜基質(zhì)膠的混合物使基質(zhì)膠固化，之后采用肺類器官培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可在同一培養(yǎng)體系下同時分化形成兩種不同形態(tài)的肺類器官。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小鼠肺類器官培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

目前，二維(2D)底物(如聚苯乙烯或玻璃)上的單層貼壁細胞培養(yǎng)已成為傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)體系的主要研究方法，但2D培養(yǎng)中細胞的形態(tài)特征、生長方式、生理功能等與體內(nèi)真實環(huán)境下存在明顯差異，生理相關(guān)性不強。近年來，大量3D細胞培養(yǎng)模型的開發(fā)顯著促進了腫瘤生物學(xué)、組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展。3D細胞培養(yǎng)模型可通過懸浮培養(yǎng)自組裝形成微球體或基于生物學(xué)支架(如細胞外基質(zhì))誘導(dǎo)分化形成類器官(Organoid)，細胞—細胞和細胞—細胞外基質(zhì)的相互作用可模擬體內(nèi)特定的細胞行為和天然組織的特異性，明顯縮短了2D培養(yǎng)與活體組織間的差距，可精準(zhǔn)預(yù)測細胞分化、器官發(fā)育和藥物毒性篩選試驗中相關(guān)基因型或表型對化合物的反應(yīng)。

在3D細胞培養(yǎng)模型中，類器官因其獨特的實驗優(yōu)勢(如穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特征、細胞通訊更加緊密、可體外長期培養(yǎng)等)，已應(yīng)用于多項基礎(chǔ)和臨床研究中。類器官是將具有干性潛能的細胞體外進行3D培養(yǎng)，形成多種特異性細胞類型集合的微器官團，其具有自我更新和自我組織能力，能夠高度模擬來源器官的三維構(gòu)造、組織學(xué)特征及生理病理狀態(tài)，可作為多種疾病的體外模型，在遺傳發(fā)育、再生醫(yī)學(xué)、疾病研究、藥物開發(fā)和精準(zhǔn)醫(yī)療等多個方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。

在干細胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目前學(xué)術(shù)界對于類器官的研究主要集中在消化系統(tǒng)(腸道、肝臟、胰腺)和神經(jīng)系統(tǒng)(大腦)，而呼吸系統(tǒng)(肺臟)類器官的研究報道相對較少，可能與目前尚缺乏成熟的肺上皮干細胞體外培養(yǎng)方法有關(guān)。肺類器官被視為體外重現(xiàn)肺上皮干細胞功能的重要途徑，再現(xiàn)了體內(nèi)肺臟發(fā)生的兩個關(guān)鍵事件，即同類細胞以黏附的方式分類聚集和空間特異性的細胞譜系定型。

現(xiàn)有技術(shù)方法中，肺類器官主要來源于胚胎干細胞或誘導(dǎo)多能干細胞，其發(fā)育需要在合適時間以可控的方式激活相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細胞命運分化及空間分離以形成不同的細胞類型，指導(dǎo)自我組織形成(干細胞生成內(nèi)胚層，內(nèi)胚層再形成三維組織)，但這種微環(huán)境的操縱不易調(diào)控，培養(yǎng)過程繁瑣、耗時，肺類器官形成率不高、活性較差，且在尺寸、結(jié)構(gòu)組織、功能和基因表達上都存在較大可變性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠肺類器官培養(yǎng)方法。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種小鼠肺類器官培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)收集50-80μm的小鼠肺球體，離心棄上清后，加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸肺球體，離心棄上清；

(2)重復(fù)步驟(1)1-2次；

(3)根據(jù)肺球體數(shù)量加入基質(zhì)膠；基質(zhì)膠的用量為每200-300個肺球體/50μL基質(zhì)膠；

(4)孵育肺球體和Matrigel基底膜基質(zhì)膠的混合物使基質(zhì)膠固化；

(5)加入肺類器官培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至二氧化碳細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

其中，所述肺球體為小鼠肺組織原代上皮干細胞球。

進一步的，所述小鼠肺球體的制備方式如下：

a.取小鼠肺葉組織塊，置于預(yù)熱的膠原酶消化溶液中消化；

b.加入等量的含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后細胞篩過濾；過濾液離心后棄除上清；

c.加入紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，室溫孵育后加入DMEM/F12培養(yǎng)基混勻，離心后棄除上清；