[發明專利]一種利用煙草表達三七皂苷的方法

在審

• 申請號: 202110093664.7
• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112877355A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 杜云龍;周璇;張利娜;萬媛媛
• 申請（專利權）人: 杜云龍
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/54;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 昆明合盛知識產權代理事務所(普通合伙) 53210
• 代理人: 龍燕

本發明公開一種利用煙草表達三七皂苷的方法，屬于生物技術領域。本發明所述方法為：參照三七的基因組序列，在兩端分別設計正反引物，克隆三七中的SS基因；將SS基因構建到植物表達載體pCAMBIA2300?35S，并命名為pCAMBIA2300?35S?SS2?1，將其轉化到農桿菌EHA105中，利用農桿菌介導的方法把含SS基因的質粒轉化煙草，當轉基因煙草生長一段時間后采集葉片，用甲醇提取煙葉中的皂苷，對煙草葉片中單體皂苷Rb1,Rd,R1,Re,Rg1含量進行檢測；結果顯示，野生型煙草總未檢測出皂苷，而在轉基因煙草植株中檢測到Rg1，Re，Rb1共3種單體皂苷。

技術領域

本發明涉及一種利用煙草表達三七皂苷的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen是五加科人參屬的草本植物，三七總皂苷是三七主要的藥用活性成分，對治療心腦血管疾病、胃腸道疾病、抑制癌細胞等方面效果顯著。三七總皂苷為達瑪烷型四環三萜皂苷，鯊烯是所有三萜皂苷及甾醇等萜烯類物質的共同前體，因此對于催化鯊烯合成的鯊烯合酶(squalene synthase,SS)基因的研究，有助于促進三七總皂苷的合成。鯊烯合酶(squalene synthase，SS)是生成三萜化合物和植物甾醇的前體，它的作用在于能使法呢基焦磷酸(farnesyldiphosphate，FPP)縮合生成鯊烯。增加植物中SS基因的含量和活性，能夠有效促進植株中三萜皂苷的合成。有研究表明，過表達SS基因會使該途徑下游其它酶的含量和活性增加，從而提高人參皂苷的產量。

隨著組培技術和轉基因技術體系逐漸成熟，煙草作為模式植物在生命科學研究領域發揮重要作用。并且煙草具有易培養、易種植、生長周期短、可收獲大量種子等特點，十分有利于轉化SS基因。轉基因煙草還因其安全、環保，生長迅速的特性成為生產生物制品的理想載體，我們將皂苷合成關鍵酶基因轉化煙草，希望利用煙草這個理想的生產生物制品的載體，可以大量提取三七皂苷。從而打破三七生產上的生長周期慢、易造成病害及連作障礙等制約三七皂苷生產的難題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用煙草表達三七皂苷的方法，具體包括以下步驟：

(1)參照三七的基因組序列，在兩端分別設計正反引物，克隆三七中的SS基因序列如SEQ ID NO:1；

所述正反引物分別是SS FP：5’-ACGCGTCGACATGGGAAGTTTGGGGGCAATTC-3’，SSRP：5’-TGGTTCTGCAGTCACTGTTTGTTCGGTAGTAG-3’；

(2)將三七SS基因克隆到植物表達載體中，使三七SS基因在35S啟動子及其它啟動子的作用下進行基因轉錄與表達；

(3)利用三七完整或部分的SS基因(CDS序列及基因組序列)轉化煙草，使三七SS基因在煙草包括煙草中表達進行皂苷合成。

本發明步驟(2)中所述所述植物表達載體為pCAMBIA2300，但并不限于pCAMBIA2300，其他滿足要求的植物載體也可用于本發明。

將SS基因構建到植物表達載體pCAMBIA2300-35S中，并命名為pCAMBIA2300-35S-SS2-1，將其轉化到農桿菌EHA105中，利用農桿菌介導的方法把含SS基因的質粒轉化煙草。