[發(fā)明專利]一種利用煙草表達三七皂苷的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110093664.7
• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112877355A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜云龍;周璇;張利娜;萬媛媛
• 申請（專利權(quán)）人: 杜云龍
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/54;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 昆明合盛知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53210
• 代理人: 龍燕

1.一種利用煙草表達三七皂苷的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)參照三七的基因組序列，在兩端分別設(shè)計正反引物，克隆三七中的SS基因序列如SEQ ID NO:1；

所述正反引物分別是SS FP：5’-ACGCGTCGACATGGGAAGTTTGGGGGCAATTC-3’，SS RP：5’-TGGTTCTGCAGTCACTGTTTGTTCGGTAGTAG-3’；

(2)將三七SS基因克隆到植物表達載體中，使三七SS基因在35S啟動子及其它啟動子的作用下進行基因轉(zhuǎn)錄與表達；

(3)利用三七完整或部分的SS基因轉(zhuǎn)化煙草，使三七SS基因在煙草包括煙草中表達進行皂苷合成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用煙草表達三七皂苷的方法，其特征在于：步驟(2)中所述所述植物表達載體為pCAMBIA2300。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用煙草表達三七皂苷的方法，其特征在于：將SS基因構(gòu)建到植物表達載體pCAMBIA2300-35S中，并命名為pCAMBIA2300-35S-SS2-1，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法把含SS基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述利用煙草表達三七皂苷的方法，其特征在于：表達載體pCAMBIA2300-35S的構(gòu)建方法為：先將35S-GFP-terminator插入pCAMBIA2300載體上，插入多克隆位點5’EcoRI/HindIII 3’之間；構(gòu)建pCAMBIA2300-35S-GFP載體，再用5’SalI--PstI3’切開GFP部分，插入SS基因替換原載體的GFP基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用煙草表達三七皂苷的方法，其特征在于：步驟(2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法把含SS基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草的具體過程為：在超凈工作臺將煙葉剪成0.5cm²大小，放入農(nóng)桿菌浸染液中浸泡3min，取出煙葉，用濾紙吸取多余浸染液后，將葉片轉(zhuǎn)入含有0.5mg/L濃度的6-BA培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)3天；經(jīng)過黑暗培養(yǎng)的煙葉轉(zhuǎn)入含有為500mg/L羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基上，25℃±1℃，光照培養(yǎng)30至45天；形成愈傷組織后，嫩芽陸續(xù)從中長出，將組織整體轉(zhuǎn)入含有羧芐青霉素和濃度為50mg/L卡那霉素的MS選擇壓培養(yǎng)基上，25℃±1℃，光照培養(yǎng)7至10天；經(jīng)過篩選后，繼續(xù)生長的煙芽從愈傷組織上分離下來，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中，25℃±1℃，光照培養(yǎng)；生根的煙草苗長至4-5cm高，有3到4片小葉時就可煉苗移栽。