[發明專利]一種生物轉化法合成膽紅素的方法

有效

• 申請號: 202110093249.1
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN113186235B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 梅建鳳;吳霞;陳樂生;鄭素晶;季軍情;易喻;應國清
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;上海和不同科技有限公司
• 主分類號: C12P17/16
• 分類號: C12P17/16;C12N9/02;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種生物轉化法合成膽紅素的方法，將表達膽綠素還原酶的重組大腸桿菌菌株產酶培養后的發酵液離心，收集菌體，經蒸餾水洗滌后作為生物催化劑，以pH 5.8、0.1mol/L的檸檬酸緩沖液為反應介質，加入膽綠素為底物，以甲醇為助溶劑構成轉化體系，在35–37℃、100–200r/min恒溫振蕩條件下轉化10–14h，轉化反應結束后，將轉化液離心，收集菌體，獲得含膽紅素的菌體，分離提取，獲得膽紅素。本發明含膽紅素的菌體中膽紅素的含量最高可達2.02％，是豬膽汁中膽紅素含量0.05％的40.4倍，從菌體中提取膽紅素的步驟相對簡單，對降低膽紅素的生產成本具有顯著效果。

(一)技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用表達膽綠素還原酶的基因重組大腸桿菌，生物轉化膽綠素合成膽紅素的方法。

(二)背景技術

膽紅素(bilirubin，CAS號635-65-4)是在一些生物體產生的一類膽色素，主要由血紅素(heme，CAS號14875-96-8)降解產生。在人體中，衰老的紅細胞在單核吞噬細胞系統的作用下，釋放出血紅蛋白，血紅蛋白隨后被分解成球蛋白和血紅素。血紅素在血紅素加氧酶(heme oxygenase，簡稱HO，EC 1.14.99.3)的作用下，將卟啉環氧化斷裂而成為膽綠素(biliverdin，CAS號114-25-0)，膽綠素進而被膽綠素還原酶(biliverdin reductase，簡稱BvdR，EC l.3.1.24)還原生成膽紅素。

健康正常的成年人個體每天產生約300mg膽紅素，膽紅素如果過量存在，會在大腦中堆積，使人易患精神疾病，或導致腦部組織受損，如新生兒核黃疸，所以在很長一段時間內，膽紅素都被認為是有毒的代謝產物。但是近年來，越來越多的研究顯示膽紅素是人體內發揮重要抗氧化作用的脂溶性抗氧化劑，當血清膽紅素水平正常或稍高時，膽紅素具有強大的抗氧化和抗炎能力，能夠清除體內的過氧化氫自由基、氧自由基，其抑制脂蛋白氧化的能力是維生素E類似物的30倍，在預防糖尿病和冠心病方面發揮著重要的作用。

膽紅素是牛黃的主要成分之一，牛黃是珍稀名貴中藥材，具有極高的藥用價值。2015版藥典中牛黃類藥品多達50余種，包括牛黃解毒片、安宮牛黃丸、牛黃上清膠囊等，但是天然牛黃來源稀少。為了緩解天然牛黃藥源短缺，我國藥學工作者在上個世紀70年代根據天然牛黃的成分，成功地研制出人工牛黃。但是，人工牛黃中膽紅素的含量與天然牛黃還是存在很大差距，提高膽紅素的含量和純度有利于提高人工牛黃的品質。此外，膽紅素也是藥典中100多種中成藥制劑的主要成份，如撲熱息痛片、銀翹解毒丸等，市場需求量大，目前市場價格高達8萬元/公斤。

目前，膽紅素基本都是從動物膽汁中提取，但膽汁中天然膽紅素含量相當低，如豬膽汁中的膽紅素含量僅為0.05％左右，由于原料來源受到限制，所以國內開發活豬造瘺引流膽汁的技術，該技術雖然解決了膽汁來源的問題，但是虐待動物的問題引起很大的社會爭議，應用受到限制。因此，開發非動物膽汁來源的膽紅素生產方法具有重要經濟價值和社會意義。

本發明以表達膽綠素還原酶的基因重組大腸桿菌細胞為生物催化劑，以膽綠素為底物生物轉化合成膽紅素(反應式見附圖1)。富含膽紅素的大腸桿菌菌體作為膽紅素提取的原料，克服了從動物膽汁中提取膽紅素原料來源不足的問題。

(三)發明內容

本發明提供一種生物轉化法合成膽紅素的方法，以表達膽綠素還原酶的大腸桿菌為催化劑，以膽綠素為底物，生物轉化合成膽紅素。該新方法解決了膽紅素只能從動物膽汁中提取的問題，生產成本較提取法顯著降低，且生產工藝具有高效、綠色環保等優點。

本發明采用的技術方案為：