[發明專利]一種生物轉化法合成膽紅素的方法

有效

• 申請號: 202110093249.1
• 申請日: 2021-01-25
• 公開（公告）號: CN113186235B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 梅建鳳;吳霞;陳樂生;鄭素晶;季軍情;易喻;應國清
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;上海和不同科技有限公司
• 主分類號: C12P17/16
• 分類號: C12P17/16;C12N9/02;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種生物轉化法合成膽紅素的方法，其特征在于所述方法為：將表達膽綠素還原酶的重組大腸桿菌菌株產酶培養后的發酵液離心，收集菌體，經蒸餾水洗滌后作為生物催化劑，以pH 5.8、0.1mol/L的檸檬酸緩沖液為反應介質，加入膽綠素為底物，以甲醇為助溶劑構成轉化體系，在35–37℃、100–200r/min恒溫振蕩條件下轉化10–14h，轉化反應結束后，將轉化液離心，收集菌體，獲得含膽紅素的菌體，分離提取，獲得膽紅素。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在轉化體系中，所述生物催化劑用量按干菌體重量計為15–18g/L；所述的底物加入終濃度為0.055–0.44g/L，所述助溶劑加入體積終濃度為10％。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述生物催化劑按如下方法制備：將表達膽綠素還原酶的重組大腸桿菌接種至含50μg/mL卡那霉素的產酶培養基中，于35–37℃、200–300r/min搖床中培養至OD₆₀₀＝0.6–1.0，加入終濃度為0.5–1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷作為誘導劑，在30–32℃，200–300r/min的搖床中表達培養只OD₆₀₀＝6.8–7.5，培養液離心，收集菌體；所述的產酶培養基終濃度組成為：甘油15–20g/L，酵母浸粉15–20g/L，(NH₄)₂SO₄ 3–5g/L，NaCl 3–5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 10–15g/L，KH₂PO₄ 2–5g/L，MgSO₄·7H₂O0.5–1.0g/L，溶劑為去離子水，pH 7.2–7.4。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于產酶培養基終濃度組成為：甘油20g/L，酵母浸粉20g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，NaCl 5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，溶劑為去離子水，pH 7.2。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述表達膽綠素還原酶的重組大腸桿菌在產酶培養前，先經活化培養，再經過種子擴大培養，獲得種子液再以體積濃度3％–5％的接種量接入產酶培養基進行培養：

(1)活化培養：將表達膽綠素還原酶的重組大腸桿菌接種于含50μg/mL卡那霉素的LB斜面培養基，于37℃恒溫培養24h，獲得斜面菌體；所述的LB斜面培養基終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L，溶劑為去離子水，pH 7.2–7.4；

(2)種子擴培：挑取步驟(1)的斜面菌體2環，接種到含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，35–37℃、150–200r/min搖床中培養至OD₆₀₀＝4.0–5.0，獲得種子液；所述的LB液體培養基終濃度組成為：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，溶劑為去離子水，pH 7.2–7.4。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述表達膽綠素還原酶的重組大腸桿菌為大腸桿菌(Escherichia coli)GDMCC No:61045。