[發明專利]一種篩選內源性抗蛇毒抑制劑的親和層析方法

在審

• 申請號: 202110090567.2
• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112755984A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 黃春洪;連琪;曹利云;傅克普;陶琴琴
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: B01J20/281
• 分類號: B01J20/281;B01D15/22;B01D15/38;C07K14/81;C07K14/765;C07K14/47
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 袁紅梅

本發明涉及一種篩選內源性抗蛇毒抑制劑的親和層析方法，本發明所涉及的毒素蛋白親和模式通過基質表面N?羥基琥珀酰亞氨(NHS)與蛇毒蛋白發生共價結合，以蛇毒蛋白的特異性親和作用吸附分離華游蛇血清的蛋白質成分。親和層析柱制備過程簡單，成本低廉；蛋白吸附量大，可以用于抗毒素蛋白的分離；對樣品無特殊要求；動態吸附載量高；洗脫方便；篩選范圍廣，直接從蛇毒免疫的動物、蛇或其天敵動物的血漿中篩選抗毒素蛋白。

技術領域

本發明涉及毒素抑制劑開發領域，特別是涉及一種用于篩選未知天然毒素抑制劑親和層析介質及其制備方法。

背景技術

蛇毒由蛇毒腺分泌，通過排毒導管進入其毒牙鞘內，經毒牙擠壓注入咬傷者體內，蛇毒具有神經毒素、肌肉毒素、血液毒素、心臟毒素，能快速地破壞人體組織，且蛇毒毒性強，對成年人致死劑量為5-25mg，因此蛇毒的致死致殘率非常高。據WHO官方統計，全球每年至少有400萬人被毒蛇咬傷，約12萬余人因得不到及時地救治而喪失生命。但蛇和其天敵卻具有廣譜且強效的抗蛇毒活性，其體內的天然抗蛇毒組分尚未得到系統解析。

本課題組曾從一種江西常見的無毒蛇—華游蛇血液中通過經高效液相色譜法等蛋白分離得到了一種新的有廣譜抗蛇毒作用的磷脂酶A2抑制劑(saPLIγ)。但是此蛋白方法得率小，耗費時間長，且只鑒定到一種蛋白抑制劑。最近，我們給華游蛇注射了2倍LD₅₀的五步蛇蛇毒(出血毒)、眼鏡蛇蛇毒(神經毒)和蝮蛇蛇毒(混合毒)，24小時后華游蛇仍然存活，中毒癥狀不明顯，皮下未見明顯的出血斑。這說明華游蛇體內很可能存在抗出血毒、抗肌肉毒和抗神經毒的活性組分，我們把這些組分稱為“抗毒素組”。目前還沒有人對華游蛇的抗毒素組進行系統研究。

傳統抗蛇毒的研究，一般采取“分離純化+活性檢測”的模式，但在這種“單鉤釣魚”的研究模式下，經常會錯失一些其他的抗蛇毒成分。因此，組學策略系統研究華游蛇抗毒素組是當下趨勢，對于我們探討華游蛇廣譜抗蛇毒機制和尋找新的蛇毒抑制劑十分必要。本發明構建“蛇毒親和柱”特異性“捕獲”華游蛇血清中抗毒素組分，通過質譜分析鑒定抗毒素組的組成，發現新型抗蛇毒蛋白組分.

本發明使用的親和層析方法是應用高分子化合物與配基可逆結合的原理,配基通過共價鍵牢固結合于填料載體上而制得的層析系統.這種可逆結合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結構的識別。將抗原(或抗體)固相化后，就可以使存在待測液相樣品中的相應抗體(或抗原)選擇性地結合在固相載體上，與液相中的其他蛋白質分開，達到分離提純的目的。具有高效、快速、簡便等優點。

因此開發一種簡單且快速的方法從血漿或勻漿液中分離抗蛇毒蛋白質組，對于抗毒素蛋白鑒定有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于構建一種構建蛇毒親和層析介質的方法，將抗毒素組從華游蛇血清或肝勻漿蛋白中捕獲出來，提供了一種“多鉤釣魚”模式的天然抗毒素蛋白篩選方法。

為實現上述目的，本發明采取下述技術方案：

本發明提供一種蛋白親和層析介質，所述毒素蛋白靜電親和模式通過基質表面N-羥基琥珀酰亞氨(NHS)與蛇毒蛋白發生共價結合，以蛇毒特異性親和作用吸附分離華游蛇樣品的蛋白質成分。本發明構建的蛇毒親和柱，可直接用于免疫后的動物血清、華游蛇血清和肝臟勻漿液的抗毒素蛋白分離。且具有操作簡單，成本低廉，過程耗時短，分離的抗蛇毒蛋白種類多等優點。

親和層析柱的構建：

稱取100mg五步蛇毒溶于10mL 0.2M碳酸氫鈉溶液(pH 8.3)中，用0.45μm濾膜過濾，留0.1mL以便測定偶聯效率。取5mL NHS活化瓊脂糖凝膠(約2mL凝膠)，用20mL 1mM鹽酸洗滌，再用上述0.2M碳酸氫鈉溶液(pH 8.3)平衡凝膠柱，將五步蛇毒溶液與凝膠混合，調節PH呈弱堿性后于室溫翻轉混合1小時或4℃過夜結合。用至少5倍柱體積的0.2M碳酸氫鈉溶液平衡凝膠柱，收集穿透液，用于計算結合效率。BCA蛋白定量法測定偶聯前后蛇毒濃度，用于計算凝膠的結合效率。