[發明專利]一種篩選內源性抗蛇毒抑制劑的親和層析方法

在審

• 申請號: 202110090567.2
• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112755984A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 黃春洪;連琪;曹利云;傅克普;陶琴琴
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: B01J20/281
• 分類號: B01J20/281;B01D15/22;B01D15/38;C07K14/81;C07K14/765;C07K14/47
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 袁紅梅

1.一種毒素蛋白親和層析介質，其特征在于，所述毒素蛋白親和層析介質由基質表面N-羥基琥珀酰亞氨與蛇毒蛋白共價結合而成。

2.如權利要求1所述的毒素蛋白親和層析介質，其特征在于，所述基質材料為NHS瓊脂糖凝膠介質。

3.一種包含如權利要求1-2任一項所述的毒素蛋白親和層析介質的親和層析柱。

4.如權利要求3所述的親和層析柱的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

(1)稱取100mg五步蛇毒溶于10mL碳酸氫鈉溶液中，用0.45μm濾膜過濾；

(2)取5mL NHS活化瓊脂糖凝膠，用20mL鹽酸洗滌，再用碳酸氫鈉溶液平衡凝膠柱，將蛇毒溶液與凝膠于室溫翻轉混合1小時或4℃過夜結合；

(3)用至少5倍柱體積的碳酸氫鈉溶液平衡凝膠柱，收集穿透液，再用乙醇胺充分洗柱以封閉膠上的未偶聯的活化位點。

5.如權利要求4所述的親和層析柱的制備方法，其特征在于，

所述碳酸氫鈉溶液濃度為0.2M，pH 8.3；

所述鹽酸濃度為1mM；

所述步驟(3)中的乙醇胺為10mM。

6.如權利要求4所述的親和層析柱的制備方法，其特征在于，所述毒素蛋白為5-15mg/mL，NHS活化瓊脂糖凝膠和毒素蛋白的體積比為1:0.5-1:2.0；所述步驟(1)所述反應在弱堿性環境中進行；毒素蛋白溶解的溫度為4℃，時間為10-12h,或室溫反應2-3h。

7.如權利要求3所述的親和層析柱的應用，其特征在于，所述親和層析柱用于分離出華游蛇樣品中的抗毒素蛋白。

8.如權利要求7所述的親和層析柱的應用，其特征在于，包括以下步驟：

a樣品處理：斷頭取新鮮華游蛇血液或提取的肝組織蛋白樣品10mL，3000rpm，低溫離心30min，獲取上清，用PBS稀釋2倍后，經0.45μm濾膜過濾，留取部分樣品用于后續分析使用；

b平衡柱子：以流速為1mL/min PBS緩沖液平衡親和層析柱，沖洗5個柱體積以上至基線平穩；

c上樣：經蠕動泵，以0.5mL/min的流速將上述樣品上樣，重復上樣2-3次或4℃孵育8h；用PBS緩沖液平衡柱子，以洗去未與填料柱結合的蛋白，至基線平穩，期間收集穿透液用于電泳檢測；

d洗脫：用1M甘氨酸-鹽酸緩沖液對結合在親和層析柱上的蛋白進行洗脫，流速為2mL/min，體積為25mL；在吸光值為280nm下檢測蛋白，收集洗脫峰。

9.如權利要求7或8所述的親和層析柱的應用，其特征在于，所述華游蛇血清和肝勻漿液中的抗毒素蛋白的成分包括：磷脂酶A2抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、小血清蛋白。