[發(fā)明專利]一種利用糖苷酶和氧胺化合物修飾DNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110088599.9
• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112920247B
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于涵洋;楊錦滔;李喆
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07H1/00;C12P19/34
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發(fā)明公開了一種利用糖苷酶和氧胺化合物修飾DNA的方法，包括如下步驟：固相合成帶有非典型堿基的DNA鏈；該帶有非典型堿基的DNA鏈在選擇性識別非典型堿基的糖苷酶的催化下，反應(yīng)產(chǎn)生帶有缺堿基位點的DNA鏈；帶有缺堿基位點的DNA鏈與氧胺化合物反應(yīng)，生成帶有化學(xué)官能團修飾的DNA。該方法可以實現(xiàn)對DNA進行多樣化定點修飾，對功能DNA的堿基結(jié)構(gòu)?功能關(guān)系進行研究，構(gòu)建更強活性的功能DNA。本方法簡單易用，可以降低修飾的成本，減少修飾所需的時間；修飾后的功能DNA活性更高，能夠為生物技術(shù)和疾病診療提供更好的工具分子。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用糖苷酶和氧胺化合物修飾DNA的方法，尤其涉及一種利用糖苷酶和氧胺化合物修飾功能DNA的方法。

背景技術(shù)

功能DNA是由科學(xué)家經(jīng)過體外篩選獲得的、折疊形成穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)的、具有結(jié)合能力或催化活性的DNA。通常，功能DNA包括DNA適體和脫氧核酶。DNA適體能夠結(jié)合特定的靶點，例如蛋白、小分子等，能夠用于靶點檢測和蛋白功能調(diào)控等。脫氧核酶能夠催化各種各樣的化學(xué)反應(yīng)，能夠應(yīng)用于化合物制備、離子傳感器、分子檢測和基因沉默等。功能DNA的應(yīng)用范圍廣泛，被用于制作各種傳感器和疾病的診斷治療領(lǐng)域。

盡管功能DNA具有這些優(yōu)點和應(yīng)用，但是跟組成蛋白質(zhì)的基本單元氨基酸側(cè)鏈相比，天然DNA的堿基所擁有的官能團種類較少，所以天然DNA的功能范圍和應(yīng)用場景仍然相對有限。針對這一問題，可以通過對DNA的堿基進行化學(xué)修飾，引入更多樣的化學(xué)官能團來解決。現(xiàn)有的DNA修飾方法主要是使用合成化學(xué)的手段制備含各類官能團的修飾堿基單體，在固相合成過程中使用這些含修飾堿基的DNA單體，最終產(chǎn)生含定點化學(xué)修飾的DNA鏈。這種方法能夠為DNA引入更多的官能團，但是合成方法步驟繁多，所需反應(yīng)條件較為苛刻，對可合成的官能團種類帶來限制，同時所需材料成本和時間成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是為DNA的修飾提供一種簡單易得、低成本、耗時短的修飾方法。

技術(shù)方案：本發(fā)明的糖苷酶和氧胺化合物的DNA修飾方法，包括如下步驟：

(1)固相合成帶有非典型堿基的DNA鏈；

(2)該帶有非典型堿基的DNA鏈在選擇性識別非典型堿基的糖苷酶的催化下，反應(yīng)產(chǎn)生帶有缺堿基位點的DNA鏈；

(3)帶有缺堿基位點的DNA鏈與氧胺化合物反應(yīng)，生成帶有化學(xué)官能團修飾的DNA。

在進行特定位點修飾特定氧胺化合物后的功能性DNA可以具有更好的功能性。

同時，可以通過正交的糖苷酶實現(xiàn)對多種非典型堿基的去除和多種氧胺化合物的修飾，實現(xiàn)對同一條DNA鏈的多個位點修飾多種不同的氧胺化合物。

由于本方法可以使用的糖苷酶可以是商業(yè)化出售的尿嘧啶DNA糖苷酶等，氧胺化合物也可以直接使用市售常見氧胺化合物，因此原料易得。

步驟(2)的缺堿基位點為糖苷酶處理后失去堿基的糖環(huán)位點。步驟(2)中的孵育和分離時間在2小時內(nèi)就可以實現(xiàn)，步驟(3)中的氧胺化合物與含有缺堿基位點的DNA反應(yīng)單一且迅速，可以在半小時內(nèi)完成，因此整個修飾流程可以很快完成。

不同糖苷酶特異性針對DNA中相應(yīng)非典型堿基去除并得到缺堿基位點。將多個相同非典型堿基引入到同一條DNA鏈，可以在多個位點同時引入多個相同的官能團修飾。將正交的多個非典型堿基引入到同一條DNA鏈，順序使用多種糖苷酶處理和氧胺化合物處理，得到不同位點含不同修飾的DNA。

步驟(1)中非典型堿基有尿嘧啶、次黃嘌呤、3甲基腺嘌呤、3甲基鳥嘌呤、7甲基鳥嘌呤或氧橋鳥嘌呤等中的一種或幾種，步驟(2)中糖苷酶有尿嘧啶DNA糖苷酶、甲基化嘌呤DNA糖苷酶或8-橋氧鳥嘌呤DNA糖苷酶等中的一種或幾種。

步驟(1)的具體包括：設(shè)計具體的修飾位點并選擇相應(yīng)非典型堿基，合成相應(yīng)DNA單鏈和對應(yīng)互補DNA單鏈。