[發(fā)明專利]小分子干擾核糖核酸及其重組腺病毒與應用

在審

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• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112725340A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 裴楊莉;李奎;李華
• 申請（專利權(quán)）人: 佛山科學技術(shù)學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/861
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 劉俊文

本發(fā)明公開了小分子干擾核糖核酸及其重組腺病毒與應用。所述小分子干擾核糖核酸，由正義鏈、反義鏈和環(huán)狀序列共同組成的shRNA，所述正義鏈和反義鏈選自以下任一組：1)序列如SEQ ID№.1所示的正義鏈和序列如SEQ ID№.2所示的反義鏈；2)序列如SEQ ID№.3所示的正義鏈和序列如SEQ ID№.4所示的反義鏈；3)序列如SEQ ID№.5所示的正義鏈和序列如SEQ ID№.6所示的反義鏈。環(huán)狀序列可采用TTCAAGAGA或其他常規(guī)間隔序列代替。該小分子干擾核糖核酸可用于制備重組腺病毒，用于抑制豬Rab32基因的表達。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及抑制Rab32基因表達的小分子干擾核糖核酸，含有該小分子干擾核糖核酸的重組腺病毒，以及應用。

背景技術(shù)

Rab蛋白是小分子GTP結(jié)合蛋白家族(small GTP-binding proteins)中最大的亞家族,目前發(fā)現(xiàn)的Rab家族成員已達60多種，其中一些Rab蛋白(如Rab5，Rab7，Rab10和Rab18等)參與自噬的調(diào)控，并影響脂質(zhì)代謝，關(guān)于Rab32確切的功能仍在研究當中。前期研究顯示Rab32在胞內(nèi)定位于線粒體。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是將與靶基因編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)導入細胞內(nèi)，使靶基因的表達降低或沉默，從而對基因功能進行研究。細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的shRNA與多種酶和蛋白組成RNA誘導的沉默復合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，識別靶基因降解靶RNA。腺病毒載體目前在基因功能研究中廣泛應用，其轉(zhuǎn)染效率高，對分裂期細胞和非分裂期細胞均具有感染能力強，安全性，且其帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供小分子干擾核糖核酸及其重組腺病毒與應用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的一個或多個技術(shù)問題，至少提供一種有益的選擇或創(chuàng)造條件。

本發(fā)明一方面提供的小分子干擾核糖核酸，由正義鏈、反義鏈和環(huán)狀序列共同組成的shRNA，所述正義鏈和反義鏈選自以下任一組：

1)序列如SEQ ID №.1所示的正義鏈和序列如SEQ ID №.2所示的反義鏈；

2)序列如SEQ ID №.3所示的正義鏈和序列如SEQ ID №.4所示的反義鏈；

3)序列如SEQ ID №.5所示的正義鏈和序列如SEQ ID №.6所示的反義鏈。

shRNA中的環(huán)狀序列可采用TTCAAGAGA或其他常規(guī)間隔序列代替。

本發(fā)明第二方面提供了含有上述小分子干擾核糖核酸的原核、真核穿梭載體、腺病毒載體。

本發(fā)明第三方面提供了含有上述小分子干擾核糖核酸的重組腺病毒。該重組腺病毒可用于抑制豬Rab32基因表達。

本發(fā)明第三方面提供了上述重組腺病毒的制備方法，包括步驟：

A.合成小分子干擾核糖核酸；

B.所述小分子干擾核糖核酸與穿梭載體進行連接，獲得抑制Rab32基因表達的重組穿梭質(zhì)粒；

C.將步驟B所得重組穿梭質(zhì)粒線性化，轉(zhuǎn)化入制備好的含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的感受態(tài)細胞，通過細胞同源重組獲得抑制Rab32基因表達的重組腺病毒載體；

D.將步驟C所得重組腺病毒載體線性化后用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染慢病毒感染細胞，獲得抑制Rab32基因表達的重組腺病毒。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述慢病毒感染細胞為293T。

附圖說明

圖1為感染細胞72小時是細胞狀態(tài)及GFP表達情況圖；