[發(fā)明專利]一種PBMC的CFSE染色方法及其應用

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• 申請日: 2021-01-22
• 公開（公告）號: CN112725271A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 朱灝
• 申請（專利權）人: 華夏源細胞工程集團股份有限公司
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12Q1/02
• 代理公司: 上海微策知識產權代理事務所(普通合伙) 31333
• 代理人: 張靜

本發(fā)明公開了一種PBMC的CFSE染色方法所述方法包括以下步驟：S1，凍存PBMC的復蘇：將PBMC凍存管融化、離心，棄去上清液，加入培養(yǎng)液重懸PBMC并計數(shù)；S2，PBMC的CFSE染色：調整PBMC的細胞濃度，量取一定體積的細胞懸液，加入CFSE染色液，染色5?10min，再加入預冷的染色終止液，離心、棄去上清液、加入的完全培養(yǎng)基重懸。在本發(fā)明中利用CFSE與賴氨酸側鏈或其他氨基基團反應，共價偶聯(lián)至細胞內和細胞表面的蛋白，在細胞分裂增殖過程中，它的熒光強度會隨著細胞的分裂而逐級遞減，標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中這一特性，對細胞進行標記，可準確檢測出細胞增殖情況。采用本發(fā)明中所述的PBMC的CFSE染色方法，對細胞增殖影響小，有利于后續(xù)的共培養(yǎng)過程。

技術領域

本發(fā)明涉及干細胞與再生醫(yī)學技術領域，尤其涉及一種PBMC的CFSE染色方法及其應用。

背景技術

間充質干細胞是一種多功能干細胞，免疫調節(jié)是評價間充質干細胞功能的重要指標之一。T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要組成，T淋巴細胞在經抗原刺激等條件激活后，可分化為多種細胞亞群，探究間充質干細胞對T淋巴細胞分化的影響，有助于更好的理解間充質干細胞對機體免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用，為未來干細胞臨床應用提供更加全面的臨床前研究證據。現(xiàn)有檢測間充質干細胞對淋巴細胞分化的方法不夠全面，存在數(shù)據波動大、不穩(wěn)定等問題。

羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(5,6-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester，CFSE)，是一種可對活細胞進行熒光標記的新型染料，可以標記活體細胞。其基本原理如下：CFSE能夠輕易穿透細胞膜，在活細胞內與胞內蛋白共價結合，水解后釋放出綠色熒光。在細胞分裂增殖過程中，它的熒光強度會隨著細胞的分裂而逐級遞減，標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半，根據這一特性，它可被用于檢測細胞增殖，細胞周期的估算及細胞分裂等方面。

本發(fā)明意在提供一種PBMC的CFSE染色方法，該染色方法可有效減少染色劑對細胞分化的影響，提高細胞在共培養(yǎng)過程的分化增值率。

發(fā)明內容

為了解決上述問題，本發(fā)明第一方面提供了一種PBMC的CFSE染色方法，所述方法包括以下步驟：

S1，凍存PBMC的復蘇：將PBMC凍存管放入水浴鍋中，搖晃至其完全融化，將融化后的PBMC轉移至含有完全培養(yǎng)基的離心管中，進行離心，棄去上清液，加入適量的培養(yǎng)液重懸PBMC并計數(shù)；

S2，PBMC的CFSE染色：調整PBMC的細胞濃度，量取一定體積的細胞懸液，加入CFSE染色液，染色5-10min，再加入預冷的染色終止液，離心、棄去上清液、加入適量的完全培養(yǎng)基重懸。

作為一種優(yōu)選的技術方案，所述方法具體包括以下步驟：

S1，凍存PBMC的復蘇：將PBMC凍存管放入水浴鍋中，搖晃至其完全融化，將融化后的PBMC轉移至含有完全培養(yǎng)基的離心管中，進行離心，棄去上清液，加入適量的培養(yǎng)液重懸PBMC并計數(shù)；

S2，PBMC的CFSE染色：加入磷酸緩沖鹽溶液調整PBMC的細胞濃度，量取5-10ml的細胞懸液，加入CFSE染色液，室溫避光染色5-10min，每隔2-3min顛倒混勻一次，再加入預冷的染色終止液，離心、棄去上清液、加入適量的完全培養(yǎng)基重懸。

作為一種優(yōu)選的技術方案，在步驟S1中，所述PBMC凍存管放入水浴鍋時，水浴鍋的溫度為36-38℃。

作為一種優(yōu)選的技術方案，步驟S1中，所述完全培養(yǎng)基中含有10wt％的胎牛血清。

作為一種優(yōu)選的技術方案，步驟S1中，所述離心時的離心力為300-500g，離心時間為5-10min。