[發(fā)明專利]一種表達(dá)人源ACE2的動(dòng)物模型及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110080692.5
• 申請(qǐng)日: 2021-01-21
• 公開（公告）號(hào): CN112680466B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周澤鑫;李華鵬;張鈺;張超;王薇薇;李舸
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州派真生物技術(shù)有限公司;廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所
• 主分類號(hào): C12N15/55
• 分類號(hào): C12N15/55;C12N15/864;C12N7/01;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

本發(fā)明公開了一種表達(dá)人源ACE2的動(dòng)物模型及其用途，本發(fā)明將小鼠AC?E2基因信號(hào)肽序列和人源ACE2基因成熟肽序列合并并經(jīng)過密碼子優(yōu)化，擴(kuò)增得到hACE2序列，并進(jìn)一步制得重組腺相關(guān)病毒AAV?hACE2；小鼠肺部插管噴射重組腺相關(guān)病毒AAV?hACE2，至少2周之后，獲得肺和腦組織高表達(dá)人源ACE2的小鼠模型。本發(fā)明在構(gòu)建新型冠狀肺炎病毒易感小鼠模型的建模速度上比較快，只需要兩周即可建模成功。本發(fā)明充分揭示了AAV?hACE2小鼠在感染新型冠病毒后的病理特征，和在新型冠狀病毒疫苗上的應(yīng)用，從而明確了該模型適用于新型冠狀病毒疫苗藥效學(xué)評(píng)價(jià)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)人源ACE2(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2)的動(dòng)物模型及其用途。

背景技術(shù)

新型冠狀肺炎COVID-19在世界范圍內(nèi)形成大流行，弄清楚其病毒感染機(jī)制、研發(fā)治療性藥物和疫苗等工作極為重要和緊迫。

SARS-COV-2新型冠狀病毒突刺(Spike)糖蛋白通過結(jié)合人體內(nèi)細(xì)胞人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體入侵機(jī)體。

但新冠肺炎病毒研究面臨的重大關(guān)鍵難題是缺乏理想的動(dòng)物模型。雖然非人靈長類動(dòng)物(如猴子)更接近人類，但由于其價(jià)格高、試驗(yàn)周期長、操作不便等問題，并不是動(dòng)物模型的理想選擇。

小鼠是潛在的理想動(dòng)物模型，但其不易感染SARS-CoV-2，因此需要構(gòu)建專門的人源ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠。

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠制備技術(shù)是DNA原核顯微注射和胚胎干細(xì)胞囊胚顯微注射法。采用傳統(tǒng)的方式進(jìn)行人源ACE2小鼠的制備需要采用構(gòu)建ACE2的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后通過供體繁育篩選純合子F0代從而建立轉(zhuǎn)基因小鼠品系。其缺點(diǎn)是篩選周期長、繁育周期長、隨機(jī)整合容易表型不穩(wěn)定、表型的組織特異性不明顯。

排除以上弊端之外，傳統(tǒng)的動(dòng)物模型如非人靈長類動(dòng)物、傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在造模過程中存在冠狀病毒攻毒后癥狀輕微不明顯等問題，很難實(shí)現(xiàn)新冠肺炎重癥或者危重癥模型的造模。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種表達(dá)人源ACE2(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2)的動(dòng)物模型及其用途，該動(dòng)物模型對(duì)SARS-COV-2易感，并可以感染SARS-CoV-2，從而實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎動(dòng)物病理模型的造模，并可用于對(duì)相關(guān)疫苗免疫效果的評(píng)估。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種表達(dá)人源ACE2的動(dòng)物模型，由以下步驟制得：

(1)將小鼠ACE2基因信號(hào)肽序列和人源ACE2基因(hACE2)成熟肽序列合并并經(jīng)過密碼子優(yōu)化，然后進(jìn)一步合成克隆載體；設(shè)計(jì)引物，以克隆載體為模板擴(kuò)增hACE2序列；

所述合并并經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的序列如SEQ.ID.NO.1所示；

所述引物的序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；

(2)酶切腺相關(guān)病毒載體，獲取線性化載體骨架，然后與hACE2序列進(jìn)行同源重組反應(yīng)，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得pAAV-hACE2；

所述的腺相關(guān)病毒載體優(yōu)選pAAV-GFP，使用AgeI、EcoRI酶切；

(3)輔助性質(zhì)粒pHelper、血清型質(zhì)粒pRep2Cap9、目的基因骨架表達(dá)載體pAAV-hACE2三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并通過梯度密度超速離心純化制備，獲取重組腺相關(guān)病毒AAV-hACE2；

步驟(3)中，輔助性質(zhì)粒pHelper、血清型質(zhì)粒pRep2Cap9、目的基因骨架表達(dá)載體pAAV-hACE2的比例優(yōu)選1:1:2；

(4)小鼠肺部插管噴射重組腺相關(guān)病毒AAV-hACE2，至少2周之后，獲得肺和腦組織高表達(dá)人源ACE2的小鼠模型；