[發(fā)明專利]齊帕特羅半抗原、完全抗原及單克隆抗體的制備和應用

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• 申請日: 2021-01-21
• 公開（公告）號: CN112679509A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設計）人: 王選年;郭東光;陳明艷;岳鋒;李文明;李夢陽;孫國鵬;潘鵬濤;李鵬;朱艷平
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)學院
• 主分類號: C07D487/06
• 分類號: C07D487/06;C07K14/765;C07K14/77;C07K16/44;G01N33/53;G01N33/543;G01N33/577;G01N33/58
• 代理公司: 西安正華恒遠知識產權代理事務所(普通合伙) 61271
• 代理人: 傅曉

本發(fā)明公開了一種齊帕特羅半抗原、完全抗原及單克隆抗體的制備和應用，包括齊帕特羅半抗原、完全抗原及單克隆抗體及其的制備方法，還包括齊帕特羅單克隆抗體在制備用于檢測齊帕特羅殘留的試劑盒或膠體金層析試紙條中的應用。本發(fā)明制備的完全抗原具有很好的免疫原性，用以制備高效穩(wěn)定的單克隆抗體，本發(fā)明將單抗的高度特異性和方法的高度敏感性有機地結合起來，達到抗原快速檢測，適宜于短時間內檢測大量樣品，能夠用于樣品中齊帕特羅殘留的檢測。

技術領域

本發(fā)明屬于免疫檢測技術領域，尤其涉及一種齊帕特羅半抗原、完全抗原及單克隆抗體的制備和應用。

背景技術

齊帕特羅(Zilpaterol,ZIL)是一種β₂-腎上腺素受體(β₂-adrenergic receptors,β2AR)激動劑，與萊克多巴胺(Ractopamine,RAC)和克倫特羅(Clenbuterol,CLB)一樣同屬于“瘦肉精”類，其主要作用是促進蛋白質合成和肌肉生長，減少脂肪組織的沉淀。當作為飼料添加劑飼喂動物后能明顯增加動物的肌肉/脂肪比，顯著提高飼養(yǎng)動物胴體瘦肉率和飼料轉化率，明顯改善肉的的品質和降低動物的養(yǎng)殖成本。

當機體攝入過量的ZIL后，會引起血管舒張，心跳過快，并且可殘留于機體的組織器官內，如肝、腎等組織器官，引起組織器官的損傷，且長期不被機體消除，超過一定量時可直接危害人體健康，出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀。

目前，ZIL在牛中的使用已經在美國、加拿大、墨西哥和南非獲得批準，但在歐盟、中國或大多數(shù)其他國家禁止使用，現(xiàn)實是國內外非法濫用嚴重存在。中國作為動物性食品消費大國，肉類食品消費占據(jù)了食品消費總和的60％以上。為獲取更高的利益，減少飼養(yǎng)成本，許多養(yǎng)殖業(yè)主非法濫用ZIL作為飼料添加劑。此外，我國有食用動物內臟(肝、腎等)的習慣，而ZIL被豬食用后主要殘留在肝、腎等組織器官，這些內臟被人食用后，與人體內靶器官細胞膜表面β2AR結合，進而引起機體損傷。

目前，ZIL的檢測方法主要包括儀器分析法和免疫學分析方法。如國外主要使用氣相色譜-質譜(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)技術對不同樣品中ZIL的檢測。國內學者建立了能夠高效檢測動物尿液中15種β2AR激動劑LC-MS/MS技術，其中也包括對ZIL的檢測。現(xiàn)有技術中還有包括ZIL在內的能夠同時檢測9種β2AR激動劑的液相二級質譜檢測技術。雖然這些方法能夠對不同樣品中ZIL做到精確的定量和定性檢測，但因儀器價格昂貴、耗時、耗力，并且需配備專用的實驗室和操作人員，以及冗長而嚴格的樣品處理程序，使得這種檢測方法的廣泛使用受到了很大限制。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于：針對目前ZIL在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用和不規(guī)范使用及其當前現(xiàn)行ZIL檢測技術存在的弊端，提供一種齊帕特羅半抗原、完全抗原及單克隆抗體的制備和應用。

本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種齊帕特羅半抗原的制備方法，包括：

將鹽酸齊帕特羅加入NaOH溶液，萃取后旋蒸溶劑，然后加入4溴丁酸乙酯和無水碳酸鉀進行反應，再用乙醇和KOH水溶液回流即得。

一種齊帕特羅完全抗原的制備方法，包括：

將齊帕特羅半抗原溶于2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸中，再加入EDC和NHS，室溫下攪拌反應2-3h，得A液；將BSA和OVA加入2-[N-嗎啉基]乙烷磺酸中，4℃冷藏18-30h，得B液；將A液緩慢滴加至B液中，室溫攪拌2-3h后于PBS溶液中透析3-5天，即得。

一種齊帕特羅單克隆抗體的制備方法，包括：

采用齊帕特羅完全抗原與弗氏完全佐劑充分乳化后形成免疫劑，取5-8周齡雌性BALB/c小鼠進行免疫，將經免疫的小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，培養(yǎng)并篩選雜交瘤細胞，得到能穩(wěn)定分泌齊帕特羅抗體的雜交瘤細胞的單克隆細胞株，純化，即得。