[發(fā)明專利]2型豬鏈球菌生物被膜相關基因Nsub敲除突變株、構建方法與應用

有效

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• 申請日: 2021-01-21
• 公開（公告）號: CN112980757B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發(fā)明（設計）人: 趙瑞利;張欣;于恩遠;李留安;潘晨浩;金天明;馬吉飛;于曉雪
• 申請（專利權）人: 天津農(nóng)學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發(fā)明公開2型豬鏈球菌生物被膜相關基因Nsub敲除突變株SS2?ΔNsub，所述突變株SS2?ΔNsub是將2型豬鏈球菌的生物被膜相關基因Nsub從第646750位至第649725位之間的編碼基因敲除后獲得的，所述被膜基因Nsub的全部編碼序列為SEQIDNO.1。本發(fā)明突變株不僅使菌株的毒力大大降低，不含有抗性篩選標記，實驗驗證也具有非常好的遺傳的穩(wěn)定性，不存在毒力返強的風險，從而保證了該菌株的安全性。同時Nsub敲除突變株SS2?ΔNsub的構建方法簡單高效，為進一步研究2型豬鏈球菌生物被膜相關基因Nsub的功能及其致病機制奠定了基礎。

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，尤其是一種2型豬鏈球菌生物被膜相關基因Nsub敲除突變株、構建方法與應用。

背景技術

豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種世界范圍內(nèi)流行的人畜共患病病原菌，不僅可致豬腦膜炎、敗血癥、關節(jié)炎、肺炎及心內(nèi)膜炎等，而且還可感染人并導致多種嚴重的疾病。豬鏈球菌血清型眾多，其中2型豬鏈球菌是豬鏈球菌35個血清型中分布最廣、致病能力最強的一種致病菌，可感染豬和人類引起腦膜炎、關節(jié)炎、敗血癥、肺炎乃至急性死亡，給公共衛(wèi)生安全帶來了嚴重威脅。而豬鏈球菌形成的生物被膜可能通過宿主免疫系統(tǒng)和抗生素引起持續(xù)感染，細菌生物膜在持續(xù)性感染中起著重要作用，生物被膜在豬鏈球菌感染的發(fā)病機制和持續(xù)性中起著關鍵作用，這些感染很少可以通過抗菌治療來根除。但是，目前關于S.suis感染宿主并致病的分子機制尚不明確。因此，進一步探索研究新的致病相關基因的功能及其在與宿主相互作用中發(fā)揮的作用，對篩選潛在的疫苗候選分子、揭示其發(fā)生發(fā)展的分子機制，進一步提高我國預防和治療水平具有重要意義。

對于豬鏈球菌毒力因子的研究一直是一個熱點，在2型豬鏈球菌中，已發(fā)現(xiàn)的毒力因子主要包括溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、纖維蛋白原結合蛋白(FBP)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等，由于毒力因子的多樣性和復雜性，僅靠毒力因子還不足以解釋導致豬鏈球菌病暴發(fā)的原因。在SS2毒力因子的研究過程中，國內(nèi)外許多學者通過構建某一基因的敲除突變株，并與野生株比較毒力變化，來揭示該基因在SS2致病中的作用，也為新型疫苗的研發(fā)奠定了理論基礎。疫苗是一種安全有效的病原菌防控手段，特別是減毒活疫苗和亞單位疫苗。基因敲除又稱基因打靶，是指基因工程中利用活細胞染色體DNA可與外源DNA序列發(fā)生重組的性質(zhì)，來進行定點修飾改造染色體上某一目的基因的技術，又稱為同源重組技術。該技術的基本原理是通過事先設計好的目標基因上下游的同源片段，和基因組發(fā)生同源交換，從而將靶基因片段置換下來，以實現(xiàn)敲除目的基因的目的。

Nsub蛋白是在多種革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)的由Nsub基因編碼的細胞表面蛋白，近年來在豬鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、變形鏈球菌、結核鏈球菌、阿萊特葡萄球菌中等均發(fā)現(xiàn)該蛋白。本申請人通過對本研究室分離鑒定的2型豬鏈球菌JS14菌株的基因組分析，發(fā)現(xiàn)一個Nsub蛋白編碼基因，據(jù)報道細胞表面蛋白Nsub與豬鏈球菌生物被膜的形成有關。作為細胞表面蛋白，可能參與一些分子功能，包括轉(zhuǎn)運體活性、核苷酸結合、運動活性、蛋白質(zhì)結合和催化活性，我們預測這些表面蛋白可能會影響細菌細胞間的相互作用。然而，Nsub的分子功能和生物學過程目前還不清楚。

通過檢測，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關的專利公開文獻。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種2型豬鏈球菌生物被膜相關基因Nsub敲除突變株及其構建方法與應用。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

2型豬鏈球菌生物被膜相關基因Nsub敲除突變株SS2-ΔNsub，所述突變株SS2-ΔNsub是將2型豬鏈球菌的生物被膜相關基因Nsub從第646750位至第649725位之間的編碼基因敲除后獲得的，所述被膜基因Nsub的全部編碼序列為SEQ ID NO.1。