[發(fā)明專利]2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub敲除突變株、構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110079019.X
• 申請日: 2021-01-21
• 公開（公告）號: CN112980757B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙瑞利;張欣;于恩遠;李留安;潘晨浩;金天明;馬吉飛;于曉雪
• 申請（專利權(quán)）人: 天津農(nóng)學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/74;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub敲除突變株SS2-ΔNsub，其特征在于：所述突變株SS2-ΔNsub是將2型豬鏈球菌的生物被膜相關(guān)基因Nsub從第646750位至第649725位之間的編碼基因敲除后獲得的，所述被膜基因Nsub的全部編碼序列為SEQ ID NO.1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub敲除突變株SS2-ΔNsub，其特征在于：所述2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub利用pSET4s質(zhì)粒的溫敏性、壯觀霉素抗性及同源重組原理篩選獲得。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub敲除突變株SS2-ΔNsub，其特征在于：所述2型豬鏈球菌為2型豬鏈球菌JS14菌株。

4.如權(quán)利要求1至3任一項所述的2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub敲除突變株SS2-ΔNsub的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟如下：

⑴構(gòu)建含有同源重組片段的重組質(zhì)粒pSET4s-Nsub，步驟如下：

①以2型豬鏈球菌基因組Nsub編碼基因的上游DNA序列為模板，設(shè)計特異性引物L1和L2，擴增Nsub基因上游同源臂L，以2型豬鏈球菌基因組Nsub編碼基因的下游DNA序列為模板，設(shè)計特異性引物R1和R2，擴增Nsub基因下游同源臂R，分別純化回收得到上游同源臂產(chǎn)物L和下游同源臂產(chǎn)物R；

L1：SEQ ID NO.2；

L2：SEQ ID NO.3；

R1：SEQ ID NO.4；

R2：SEQ ID NO.5；

②將溫敏型自殺性質(zhì)粒PSET4s用EcoRI和HindIII酶切后切膠回收；

③將純化回收得到上游同源臂產(chǎn)物L和下游同源臂產(chǎn)物R與純化回收得到質(zhì)粒PSET4s加入等體積的DNA片段的克隆試劑，混合均勻后50℃反應(yīng)15min；

④吸取反應(yīng)產(chǎn)物至已經(jīng)融化好的Mach1-T1感受態(tài)細胞中，混勻后冰10min，冰浴結(jié)束后，放置42℃水浴鍋中，熱激120s，取出繼續(xù)冰浴3min；冰浴結(jié)束后加入不含抗性的LB液體培養(yǎng)基，反應(yīng)產(chǎn)物：不含抗性的LB液體培養(yǎng)基的體積比為1：20，置于37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中220rpm培養(yǎng)30min；

⑤取出37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中的產(chǎn)物，3000rpm離心4min，于超凈臺中取出上清棄之，將剩余液體吹打混勻，均勻涂在平板上，將其置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；

⑥挑取平板中的單菌落擴大培養(yǎng)，12h后抽提質(zhì)粒并送測序部進行測序；

⑦將測序部發(fā)回的測序結(jié)果與目標序列進行比對，篩選出正確的克隆進行保存，獲得重組質(zhì)粒pSET4s-Nsub；

⑵將獲得的重組質(zhì)粒pSET4s-Nsub電轉(zhuǎn)化入2型豬鏈球菌強毒株內(nèi)，通過溫度、壯觀霉素及同源重組原理篩選獲得2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub敲除突變株SS2-ΔNsub。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的2型豬鏈球菌生物被膜相關(guān)基因Nsub敲除突變株SS2-ΔNsub的構(gòu)建方法，其特征在于：所述步驟⑴③中DNA片段的克隆試劑為無縫克隆重組Mix 2×Seamless Cloning Mix；

所述步驟⑴⑥中挑取平板中的單菌落于裝有液體培養(yǎng)基的試管中擴大培養(yǎng)。