[發明專利]一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法

在審

• 申請號: 202110078904.6
• 申請日: 2021-01-23
• 公開（公告）號: CN112779345A
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 周順;于明明;修云吉;黃晴;李影
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州歐凱專利代理事務所(普通合伙) 41166
• 代理人: 王林華

1.一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法，所述方法包括以下步驟：

S1、引物的設計與合成：根據GenBank中已知殺鮭氣單胞菌毒力列陣蛋白基因（vapA）序列，通過引物設計軟件Primer Explore V4設計六條特異性引物；

S2、模板制備：從實驗室取出貯備的樣品菌株，將菌株接種于TSB培養基中，在28℃的溫度下過夜培養，培養完成后用OMEGA Tissue DNA kit試劑盒提取DNA；

S3、LAMP擴增體系：25μL體系為BstDNAPolymerase（8U/μL）、10×IsothermoBuffer（Mg²⁺free）、MgSO₄（100mM）、dNTPMixture（10mM）、10×Primers（FIP/BIP分別為16μM、LoopF/LooB分別為8μM、F3/B3分別為2μM）、滅菌雙蒸水、羥基萘酚藍染料（HNB）、細菌模板1μL；

S4、LAMP擴增條件：在63℃溫度下反應60min，85℃溫度反應10min后終止反應，此反應條件的擴增產物顯色結果最明顯；

S5、LAMP結果檢測：

反應前加入顯色劑：LAMP擴增結束后，陽性呈藍色；陰性呈紫羅蘭色；

電泳驗證：將擴增產物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可顯現出條帶。

2.根據權利要求1所述的一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法，其特征在于：所述S2步驟中實驗室貯備的細菌由發病魚體內分離得到，所述菌株種類有大菱鲆弧菌、嗜水氣單胞菌、創傷弧菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血弧菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、美人魚發光桿菌。

3.根據權利要求1所述的一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法，其特征在于：所述S2步驟中實驗室貯備樣品菌株的溫度為零下80℃。

4.根據權利要求1所述的一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法，其特征在于：所述S3步驟中對酶量、Mg²⁺濃度、dNTP濃度及引物量可做一定程度的優化，且可選取最佳用量。