[發明專利]一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法

在審

• 申請號: 202110078904.6
• 申請日: 2021-01-23
• 公開（公告）號: CN112779345A
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 周順;于明明;修云吉;黃晴;李影
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州歐凱專利代理事務所(普通合伙) 41166
• 代理人: 王林華

本發明公開了一種殺鮭氣單胞菌LAMP?HNB快速檢測方法，涉及殺鮭氣單胞菌LAMP?HNB快速檢測方法技術領域，所述方法包括以下步驟：S1、引物的設計與合成：根據GenBank中已知殺鮭氣單胞菌毒力列陣蛋白基因（vapA）序列，通過引物設計軟件Primer Explore V4設計六條特異性引物。該殺鮭氣單胞菌LAMP?HNB快速檢測方法，通過設置的LAMP方法對殺鮭氣單胞菌的最低檢測濃度為2x10¹ CFU/mL，比普通PCR的檢測靈敏度高10²倍，有效的提高了檢測靈敏度，該殺鮭氣單胞菌LAMP?HNB快速檢測方法，通過設計的具有六條特異性引物，該體系可以特異性的檢測到殺鮭氣單胞菌，對其他菌株無擴增，且瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，只有殺鮭氣單胞菌發生了擴增，對殺鮭氣單胞菌檢測的特異性較強。

技術領域

本發明涉及殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法技術領域，具體為一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法。

背景技術

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)最早由Emmerich和Weible在1890年從鱒魚中分離并進行了描述；殺鮭氣單胞菌為革蘭氏陰性菌，屬氣單胞菌科、氣單胞菌屬，菌體不運動，兼性厭氧；目前殺鮭氣單胞菌分為無色亞種、殺鮭亞種、殺日本鮭亞種、溶果膠亞種、史式亞種五種；該菌可引起鮭鱒魚類癤瘡病，患病魚類體表可形成紅色膿腫，嚴重時可發展成潰瘍，嚴重制約了養殖業的健康發展；2005年Bjrnsdóttir等人發現殺鮭氣單胞菌對大菱鲆存在一定的致病性，病理變化表現為大菱鲆肝臟出血，體表潰瘍等。

殺鮭氣單胞菌的檢測方法主要還是常規的生理生化鑒定，操作復雜，耗時長，很難獲得準確的結果，延誤病情診斷，隨著分子生物學的發展，各種技術得到發展，16S rRNAPCR方法、ELISA快速檢測法、實時定量PCR、RAPD方法等均可快速檢測病原，但這些方法耗時較長、操作復雜，急需一種簡便快速的檢測方法來解決上述問題。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法，解決了隨著分子生物學的發展，各種技術得到發展，16S rRNA PCR方法、ELISA快速檢測法、實時定量PCR、RAPD方法等均可快速檢測病原，但這些方法耗時較長、操作復雜的問題。

(二)技術方案

為達到以上目的，本發明采取的技術方案是：一種殺鮭氣單胞菌LAMP-HNB快速檢測方法，所述方法包括以下步驟：

S1、引物的設計與合成：根據GenBank中已知殺鮭氣單胞菌毒力列陣蛋白基因(vapA)序列，通過引物設計軟件Primer Explore V4設計六條特異性引物；

S2、模板制備：從實驗室取出貯備的樣品菌株，將菌株接種于TSB培養基中，在28℃的溫度下過夜培養，培養完成后用OMEGA Tissue DNA kit試劑盒提取DNA；

S3、LAMP擴增體系：25μL體系為BstDNAPolymerase(8U/μL)、10×IsothermoBuffer(Mg²⁺free)、MgSO₄(100mM)、dNTPMixture(10mM)、10×Primers(FIP/BIP分別為16μM、LoopF/LooB分別為8μM、F3/B3分別為2μM)、滅菌雙蒸水、羥基萘酚藍染料(HNB)、細菌模板1μL。

S4、LAMP擴增條件：在63℃溫度下反應60min，85℃溫度反應10min后終止反應，此反應條件的擴增產物顯色結果最明顯；

S5、LAMP結果檢測：

(1)、反應前加入顯色劑：LAMP擴增結束后，陽性呈藍色；陰性呈紫羅蘭色；

(2)、電泳驗證：將擴增產物在2％瓊脂糖凝膠電泳中電泳可顯現出條帶。