[發明專利]一種沙門氏菌閉管快速可視化檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 202110078752.X
• 申請日: 2021-01-21
• 公開（公告）號: CN112391486B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 許文濤;杜再慧;林晟豪;李佳樂
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

本發明提供一種沙門氏菌閉管快速可視化檢測試劑盒及其檢測方法。該沙門氏菌快速檢測試劑盒包含如下組分：集成管、納米金增強的LAMP擴增體系、以及負染檢測的相關試劑。本發明將納米金增強的LAMP恒溫擴增和負染可視化技術結合起來，實現了對沙門氏菌的閉管檢測，具有三重防污染、快速、特異性強、高靈敏、可視化等特點。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種沙門氏菌閉管快速可視化檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

沙門氏菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧型微生物，最適生長溫度是37℃，在20℃以上即可大量繁殖，且在低溫條件下可以存活3~4個月。它是最常見的食源性致病菌，常存在于人畜腸道內，為人畜共患病原體。據統計，我國內陸地區在細菌性食物中毒中沙門氏菌位于首位。目前沙門氏菌檢測的金標準為生化特性檢測，即發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇產氣；不發酵乳糖、蔗糖；不產生吲哚、V-P反應陰性；不水解尿素和對苯丙氨酸不脫氨。但是該方法耗時耗力，對于沙門氏菌的現場快速檢測需求難于滿足。近年來，隨著分子生物學的迅猛發展，鑒定沙門氏菌的方法擴展到免疫學方法和分子生物學方法。最為常見的分子生物學方法中以PCR和LAMP擴增為主，針對沙門氏菌的特異性基因組進行引物設計，實現沙門氏菌的快速檢測。隨著科學水平的不斷發展，人們的生活水平不斷提高，因此針對于食品病原菌的快速檢測也提出了更高的要求，即能夠實現現場、快速、高靈敏、強特異、低成本等特點。

其中LAMP擴增是一種成熟的等溫擴增技術，該技術利用內引物、外引物與聚合酶結合，在恒溫條件下進行等溫擴增反應，非常適合于目前對于沙門氏菌檢測的要求。但是該方法的擴增效率與易污染一直都是該技術方法開發的難題。由于LAMP引物設計的特殊性，該反應自身就具有高擴增效率，但是靶標不存在時也能擴增出假陽性的現象，即擴增效率與假陽性現象緊密相關。目前針對于納米材料對于核酸擴增技術的影響研究越來越多，但是還沒有相關文獻報道納米材料對于LAMP擴增效率的影響。且LAMP易污染問題除了注意操作環境、引物設計外沒有更好的解決辦法。

基于此，本申請提供一種沙門氏菌閉管快速可視化檢測試劑盒及其檢測方法。閉管檢測實現了沙門氏菌的三重防污染檢測，即通過集成管的螺口密封，石蠟油液封以及CuSO₄實現；提升LAMP擴增效率通過增加納米金實現；可視化通過CuSO₄與陰性樣品混合負染生成環形聚集物實現。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種沙門氏菌閉管快速可視化檢測試劑盒及其檢測方法。本發明將納米金增強的LAMP恒溫擴增和CuSO₄負染可視化結合起來，實現了對沙門氏菌的閉管檢測，具有三重防污染、快速、特異性強、高靈敏、可視化等特點。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種沙門氏菌檢測試劑盒，包括如下組分：集成管、納米金增強的LAMP擴增體系以及負染檢測相關試劑；

集成管為自制螺口管，有管身和管蓋組成；負染檢測相關試劑提前風干于集成管管蓋內側。

納米金增強的LAMP擴增體系包括如下組分：LAMP擴增引物、dNTPs、甜菜堿、MgSO₄、緩沖液、Bst DNA聚合酶、納米金、石蠟油及水；

其中LAMP擴增引物包括：

inv A-F3引物：序列如SEQ ID NO：1；

inv A-B3引物：序列如SEQ ID NO：2；

FIP引物：序列如SEQ ID NO：3；

BIP引物：序列如SEQ ID NO：4；

負染檢測相關試劑為0.1M CuSO₄溶液，提前取5μL CuSO₄溶滴加在集成管管蓋上風干。