[發明專利]一種化學發光免疫分析校準品或質控品用抗原的制備方法

在審

• 申請號: 202110078253.0
• 申請日: 2021-01-21
• 公開（公告）號: CN112851801A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 徐智盼;黃芳
• 申請（專利權）人: 南京基蛋生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/20;G01N33/72
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本發明公開了一種化學發光免疫分析校準品或質控品用抗原的制備方法，純化天然豬源肌紅蛋白，具體依次包括以下步驟：豬心組織勻漿、硫酸銨沉淀、離子交換層析和疏水層析，本發明采用豬源肌紅蛋白代替人源肌紅蛋白，可解決原料來源問題，另外，該制備方法步驟簡單，得到肌紅蛋白產量高，有效活性濃度高，可滿足大規模生產；同時，滿足化學發光免疫分析校準品或質控品的要求，線性相關性好，穩定性能較重組肌紅蛋白更穩定，37℃加速7天降幅≤5%。

技術領域

本發明涉及蛋白純化領域，具體涉及一種化學發光免疫分析校準品或質控品用抗原的制備方法。

背景技術

肌紅蛋白(Myoglobin,Mb)是一種氧結合球蛋白，由一條肽鏈和一個血紅素輔基組成，廣泛存在于人和其他哺乳動物的心肌和骨骼肌中。血紅素輔基是鐵原子與卟啉化合物形成的復合物，由4個吡咯通過4個甲炔基相連形成一個大環，Fe2+位于吡咯環中央。人肌紅蛋白與豬肌紅蛋白均由154個氨基酸殘基組成，分子量為16.7kDa；肌紅蛋白分子排列緊密，一分子蛋白結合一分子氧，這種結構使得肌紅蛋白在貯存和輸送氧的過程更快發揮作用。

在急性心肌損傷時，肌紅蛋白會最先被釋放在血液中，2-4h后血中的Mb超出正常上限，6-12h達到高峰；因此Mb水平的檢測可以輔助快速確診疾病并及時進行治療，從而降低病死率。市場上Mb的檢測方法有ELISA法、RIA法、化學發光免疫分析法、熒光免疫測定法、免疫比濁法等；Mb原料在診斷類試劑盒中主要被用作校準品或質控品，用于提高檢測的準確性及精確度；目前國內的檢測試劑盒多使用進口Mb原料，價格昂貴，很大程度上限制了Mb檢測的推廣和應用。因此急需研發一種高性能Mb原料，擺脫進口原料依賴，助力于國內的檢測試劑盒。

現有技術主要使用重組肌紅蛋白抗原或天然提取人肌紅蛋白抗原作為診斷試劑原料，重組肌紅蛋白抗原穩定性較差，制備成校準品或質控品后，37℃加速穩定性只能穩定3-4天；人心肌來源的肌紅蛋白，來源較為困難，很難進行大規模生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種化學發光免疫分析校準品或質控品用抗原的制備方法，解決重組肌紅蛋白抗原穩定性差等問題，獲得高活性和穩定性的天然豬源肌紅蛋白抗原，為臨床檢測心肌損傷及預后提供診斷試劑原料，為急性心肌梗死等心臟類疾病的快速診斷試劑盒的研發奠定了基礎。

本發明采用的技術方案如下：一種化學發光免疫分析校準品或質控品用抗原的制備方法，所述的抗原為肌紅蛋白，該肌紅蛋白制備采用純化天然豬源肌紅蛋白，具體依次包括以下步驟：豬心組織勻漿、硫酸銨沉淀、離子交換層析和疏水層析。

優選地，離子交換層析過程中平衡和洗脫采用的試劑都是Tris-EDTA緩沖液，具體優選為10-100mM Tris，1-5mM EDTA，pH7.0-9.0。

優選地，離子交換層析前，將硫酸銨沉淀獲得粗提蛋白進行復融、透析和膜過濾。

優選地，疏水層析平衡和洗脫所用的試劑由Tris-EDTA緩沖液和硫酸銨鹽組成，洗脫所用試劑硫酸鹽的濃度為平衡所用試劑硫酸鹽鹽濃度的0.25-0.75倍。具體優選為，疏水層析平衡所用的試劑為疏水層析平衡所用的試劑為10-100mM Tris，1-5mM EDTA，2-3M硫酸銨，pH7.0-9.0,疏水層析洗脫所用的試劑為10-100mM Tris，1-5mM EDTA，0.5-1.5M硫酸銨，pH7.0-9.0。

優選地，疏水層析前，將離子交換層析獲得的較純肌紅蛋白樣品透析。

優選地，硫酸銨沉淀包括以下步驟：

S21、將豬心組織勻漿獲得粗提液經70％硫酸銨沉淀，棄沉淀，得上清；

S22、將步驟S21得到上清液經100％硫酸銨沉淀，棄上清，取沉淀，獲得粗提蛋白。

優選地，所述的豬心組織勻漿具體步驟：取豬心組織，制成勻漿狀，離心，取上清，獲得豬心組織勻漿上清液。