[發(fā)明專利]唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法及試劑盒

在審

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• 申請日: 2021-01-20
• 公開（公告）號: CN113009006A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設計）人: 林高坤;徐斌;林鈺庭
• 申請（專利權）人: 泊邁生物醫(yī)學檢測（蘇州）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 蘇州企知鷹知識產權代理事務所(普通合伙) 32420
• 代理人: 蔡天明

本發(fā)明涉及一種唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法及試劑盒其中，所述方法，包括：標準品配制：質控品配制：標準品處理，采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測：唾液樣品前處理，采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測：校準曲線：采用同位素內標定量法，以標準品與內標物的濃度比為X軸、標準品與內標物峰面積比為Y軸，建立標準曲線，計算待測樣本中脫氫表雄酮的含量。本發(fā)明采用高效液相色譜串聯質譜技術將脫氫表雄酮與干擾物分離，再結合同位素內標定量法唾液中脫氫表雄酮的含量進行測定，通過使脫氫表雄酮與甲氧胺反應生成肟酯，顯著提高了檢測靈敏度，通過采用反應檢測模式(MRM)保證了檢測方法的特異性。

技術領域

本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法及試劑盒。

背景技術

脫氫表雄酮(DHEA)是由腎上腺皮質分泌的一種甾體激素，是雄性激素和雌性激素合成的前體物質，具有廣泛的生理和病理作用。DHEA被分泌至血液中大部分經過代謝形成結合型DHEA，這些結合型DHEA生理活性較弱，而剩余的DHEA稱之為游離型DHEA，主要發(fā)揮生理活性的是這類DHEA。血液中游離型DHEA通過唾液腺上皮細胞被動擴散至唾液中，因此唾液中DHEA含量被認為可以用于評估人體中游離DHEA的水平。

傳統(tǒng)的用于檢測DHEA的方法主要有酶聯免疫法和化學發(fā)光免疫分析法等，這些方法容易受到樣本中DHEA結構類似物的干擾導致檢測結果的偏離。近年來，高效液相色譜串聯質譜技術被開發(fā)應用于檢測人體液中DHEA的含量，然而由于DHEA分子結構原因，直接檢測會發(fā)現DHEA的電離效率不佳，加之其在唾液中含量很低，因此直接檢測的靈敏度達不到要求。

發(fā)明內容

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法及試劑盒，具有特異性強、靈敏度高的優(yōu)點。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：

一種唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，包括：

標準品配制：取脫氫表雄酮標準品，用乙腈作為溶劑配制1mg/mL的脫氫表雄酮標準品母液后，用乙腈稀釋得到100ng/mL脫氫表雄酮標準品溶液；取d6-脫氫表雄酮標準品，用乙腈作為溶劑配制1mg/mL的內標母液后，用乙腈稀釋得到1μg/mL內標溶液，再稀釋配制得到2.5ng/mL的實驗用內標溶液；

質控品配制：取脫氫表雄酮標準品溶液用唾液空白基質稀釋定容得到20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL三個濃度梯度的質控品；

標準品處理：取所述脫氫表雄酮標準品溶液用空白唾液基質溶液定容得到10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL七個濃度梯度的脫氫表雄酮校準溶液，再分別取500μL各濃度的所述脫氫表雄酮校準溶液于2mL的離心管內，于每管中加入20μL所述內標溶液和1mL萃取液，渦旋震蕩5min后，在13000r/min轉速下離心10min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，向吹干離心管中加入衍生劑，避光水浴反應，反應完成后向離心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，渦旋振蕩5min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，以100μL60％乙腈水復溶，渦旋震蕩1min后，以13000r/min轉速離心5min，取20μL上清液采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測；

唾液樣品前處理：取500μL唾液樣品于2mL離心管中，加入20μL所述內標溶液和1mL萃取液，渦旋震蕩5min后，在13000r/min轉速下離心10min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，向吹干離心管中加入衍生劑，避光水浴反應，反應完成后向離心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，渦旋振蕩5min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，以100μL60％乙腈水復溶，渦旋震蕩1min后，以13000r/min離心5min，取20μL上清液采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測；