[發明專利]唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110075247.X
• 申請日: 2021-01-20
• 公開（公告）號: CN113009006A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 林高坤;徐斌;林鈺庭
• 申請（專利權）人: 泊邁生物醫學檢測（蘇州）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 蘇州企知鷹知識產權代理事務所(普通合伙) 32420
• 代理人: 蔡天明

1.一種唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，包括：

標準品配制：取脫氫表雄酮標準品，用乙腈作為溶劑配制1mg/mL的脫氫表雄酮標準品母液后，用乙腈稀釋得到100ng/mL脫氫表雄酮標準品溶液；取d6-脫氫表雄酮標準品，用乙腈作為溶劑配制1mg/mL的內標母液后，用乙腈稀釋得到1μg/mL內標溶液，再稀釋配制得到2.5ng/mL的實驗用內標溶液；

質控品配制：取脫氫表雄酮標準品溶液用唾液空白基質稀釋定容得到20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL三個濃度梯度的質控品；

標準品處理：取所述脫氫表雄酮標準品溶液用空白唾液基質溶液定容得到10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL七個濃度梯度的脫氫表雄酮校準溶液，再分別取500μL各濃度的所述脫氫表雄酮校準溶液于2mL的離心管內，于每管中加入20μL所述內標溶液和1mL萃取液，渦旋震蕩5min后，在13000r/min轉速下離心10min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，向吹干離心管中加入衍生劑，避光水浴反應，反應完成后向離心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，渦旋振蕩5min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，以100μL 60％乙腈水復溶，渦旋震蕩1min后，以13000r/min轉速離心5min，取20μL上清液采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測；

唾液樣品前處理：取500μL唾液樣品于2mL離心管中，加入20μL所述內標溶液和1mL萃取液，渦旋震蕩5min后，在13000r/min轉速下離心10min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，向吹干離心管中加入衍生劑，避光水浴反應，反應完成后向離心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，渦旋振蕩5min，轉移有機相至另一2mL離心管，氮氣吹干，以100μL 60％乙腈水復溶，渦旋震蕩1min后，以13000r/min離心5min，取20μL上清液采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測；

校準曲線：采用同位素內標定量法，以標準品與內標物的濃度比為X軸、標準品與內標物峰面積比為Y軸，建立標準曲線，計算待測樣本中脫氫表雄酮的含量。

2.根據權利要求1所述的唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，所述采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測時的色譜條件為：流動相A采用體積比為0.1％甲酸水溶液、流動相B采用濃度為100％的乙腈。

3.根據權利要求1或2所述的唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，所述采用高效液相色譜串聯質譜技術進行分析檢測時的質譜條件為：在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式，噴霧電壓為5500V，碰撞氣為8，氣簾氣為30psi，離子源溫度為550℃，離子源氣流GS1為70psi、GS2為50psi。

4.根據權利要求3所述的唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，所述標準品處理步驟與所述唾液樣品前處理步驟中，避光水浴反應溫度為60℃，反應時長為30min。

5.根據權利要求1所述的唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，所述空白唾液基質溶液由3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得。

6.根據權利要求1所述的唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，所述萃取液為甲基叔丁基醚。

7.根據權利要求1所述的唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，所述衍生劑為以50％甲醇水為溶劑、濃度為50mmol/l的甲氧胺鹽酸鹽溶液。

8.根據權利要求1所述的唾液中脫氫表雄酮含量檢測方法，其特征在于，所述方法還包括精密度試驗步驟，包括：

取同一唾液樣本均分為5-8份作為第一測試樣本組，以同位素內標定量法依次測定所述第一測試樣本組中脫氫表雄酮的含量，并計算得到批內精密度；

取同一唾液樣本均分為5-8份作為第二測試樣本組，連續3-5日以同位素內標定量法按照相同時間間隔依次測定所述第二測試樣本組中脫氫表雄酮的含量，并計算得到批間精密度。