[發(fā)明專利]一株高產(chǎn)β-胡蘿卜素的解脂耶氏酵母及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110075231.9
• 申請(qǐng)日: 2021-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112831427B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祁慶生;侯進(jìn);劉萌萌;張瑾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12P23/00;C12R1/645
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李箏

本發(fā)明具體涉及一株高產(chǎn)β?胡蘿卜素的解脂耶氏酵母及其應(yīng)用。所述菌株能夠利用普通碳源和氮源，經(jīng)高密度培養(yǎng)后，β?胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到7.8g/L，含量達(dá)到161mg/g DCW，是高產(chǎn)β?胡蘿卜素的優(yōu)良菌株。該工程菌株以將CarRP和CarB基因定點(diǎn)整合至zeta位點(diǎn)的低產(chǎn)β?胡蘿卜素解脂耶氏酵母菌株T1為出發(fā)菌，將內(nèi)源關(guān)鍵酶HMGs、HMGCR、ERG20、GGS1、ERG8、ERG12、ERG19及IDI進(jìn)行多輪隨機(jī)整合，并引入外源GGPP合成酶GPS(可將IPP和DMAPP直接催化成GGPP)和血紅蛋白VHb，最后對(duì)降低脂質(zhì)體降解的關(guān)鍵基因AAL8進(jìn)行敲除得到該高產(chǎn)菌株。作為一種β?胡蘿卜素生產(chǎn)工程菌，在食品、飼料、醫(yī)藥及化妝品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于工程菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株解脂耶氏酵母菌(Yarrowialipolytica)GVD-A，其構(gòu)建方法、及所述菌株作為β-胡蘿卜素生產(chǎn)工程菌的應(yīng)用； 本發(fā)明還包括上述菌株的菌劑，及在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、醫(yī)藥及化妝品工業(yè)領(lǐng) 域的應(yīng)用。

背景技術(shù)

公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不 必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所 公知的現(xiàn)有技術(shù)。

迄今為止，已報(bào)道了700多種類胡蘿卜素，植物、細(xì)菌、藻類和酵母皆可是 其來(lái)源，β-胡蘿卜素是其中之一。β-胡蘿卜素可作為維生素A的前體，是世界衛(wèi) 生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)認(rèn)定的A類全營(yíng)養(yǎng)食品強(qiáng) 化劑，已被世界上52個(gè)國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)使用。β-胡蘿卜素具有抗氧化、保護(hù)視 力、抗衰老、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗輻射、預(yù)防血管硬化和提高免疫力等許多 重要的生理功能，在食品、藥品、保健品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前β- 胡蘿卜素的生產(chǎn)方法主要有三種：化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法。化 學(xué)合成法工藝流程復(fù)雜、能耗高、污染大；β-胡蘿卜素在植物中含量通常很低， 植物提取法對(duì)野生植物資源造成嚴(yán)重破壞；相比之下，微生物發(fā)酵法不受原料的 限制、生產(chǎn)過(guò)程綠色清潔，具有很大的優(yōu)勢(shì)。目前微生物制備β-胡蘿卜素，主要 菌種有杜氏鹽藻和三孢布拉氏霉。杜氏鹽藻(Dunaliella)和三孢布拉氏霉 (Blakeslea trispro)的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)比較成熟，均已經(jīng)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)，其中三 孢布拉氏霉培養(yǎng)5天β-胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá)800～900mg/L，杜氏鹽藻發(fā)酵β-胡蘿 卜素在干菌體中的含量可達(dá)10％。但是三孢布拉氏霉由于霉菌的生殖方式等原 因，其性狀易發(fā)生衰退，藻類養(yǎng)殖條件要求苛刻，這些不足限制了其發(fā)展。因此， 提供一株易于發(fā)酵培養(yǎng)的高產(chǎn)β-胡蘿卜素的菌株具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述研究背景，本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌株產(chǎn)量低的 缺陷，旨在提供一種β-胡蘿卜素的高產(chǎn)菌種。基于該目的，本發(fā)明以原本不產(chǎn)β- 胡蘿卜素的解脂耶氏酵母菌株(Yarrowia lipolytica)作為出發(fā)菌株，將CarRP和 CarB基因定點(diǎn)整合至zeta位點(diǎn)，以此低產(chǎn)β-胡蘿卜素的解脂耶氏酵母菌株T1 為出發(fā)菌，將內(nèi)源關(guān)鍵限速酶進(jìn)行多輪隨機(jī)整合，并引入外源GGPP合成酶GPS 和血紅蛋白VHb，最后對(duì)脂質(zhì)體降解的關(guān)鍵基因乙酰CoA連接酶AAL8進(jìn)行敲 除得到一種高產(chǎn)β-胡蘿卜素的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，有 望成為一種β-胡蘿卜素生產(chǎn)的工程菌進(jìn)行應(yīng)用。

基于上述研究結(jié)果，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明第一方面，提供一種β-胡蘿卜素的工程菌，所述工程菌被修飾為與內(nèi) 源活性相比，具有增強(qiáng)的CarB、CarRP、GGPP合成酶GPS、血紅蛋白VHb、GGS1 及MVA途徑相關(guān)酶活性，同時(shí)具有減弱的β-氧化酶活性。

本發(fā)明效果較好的一種具體實(shí)施方式中，采用解脂耶氏酵母菌株(Yarrowialipolytica)作為出發(fā)菌株，經(jīng)本發(fā)明方法修飾后獲得解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)GVD-A，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)β-胡蘿卜素的效果。