[發明專利]一種用于牛病毒性腹瀉病毒分型的一步法雙重RT-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202110071124.9
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN113174446A
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 歐云文;王勤;劉俐君
• 申請（專利權）人: 開江縣動物疫病預防控制中心;達州職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛芹

本發明公開了一種用于牛病毒性腹瀉病毒分型的一步法雙重RT?PCR檢測方法，該引物組由發明人根據GenBank公布的BVDV?1和BVDV?2流行毒株5'?UTR保守序列，設計2組特異性引物，所得目的基因擴增片段大小分別為279bp和180bp。建立的BVDV雙重RT?PCR不與牛傳染性鼻氣管炎病毒等發生交叉反應，可用于了解樣品采集地牛群BVDV的感染情況，建立的BVDV雙重RT?PCR檢測方法具有良好的特異性和敏感性，可用于田間樣品的常規檢測。采用本發明建立的雙重RT?PCR方法檢測了我國2017?2020年西部4個不同省(直轄市)不同牛場的總共1154份田間樣品，結果顯示389份預混樣品中BVDV?1陽性率為8.48％，BVDV?1陽性率為9.51％，BVDV?1+BVDV?2陽性率為2.83％，具有一定臨床應用價值，可用于臨床BVDV的檢測。

技術領域

本發明涉及獸醫分子生物學檢測技術領域，具體涉及一種用于牛病毒性腹瀉病毒分型的一步法雙重RT-PCR檢測方法。

背景技術

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是引起牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)又稱粘膜病(Mucosal disease，MD)的主要病原，宿主動物可出現腹瀉、急慢性黏膜感染、繁殖和免疫障礙，同時伴有其他病原的繼發感染與混合感染。耐過犢牛則成為持續感染動物(PI)，PI牛終生帶毒且不斷向外排毒，成為BVDV的重要傳染源，難以凈化，給養牛業的安全生產帶來了嚴重的挑戰。

BVDV是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，BVDV主要分為2種基因型，即BVDV-1型和BVDV-2型。BVDV-1型的主要癥狀為一過性發熱、腹瀉和急慢性粘膜病。BVDV-2型的癥狀主要表現為發燒、腹瀉、呼吸失調和血小板減少等，主要導致奶牛流產，對牛的致死性較高。近年來，BVDV-1型和BVDV-2 型均在我國被報道，兩個基因型間具有一定交叉保護作用，但無法達到高效保護。目前，檢測BVDV-1型和BVDV-2型的PCR方法已有研究報道，但其先對病毒RNA進行逆轉錄，再進行PCR擴增，操作較為繁瑣，極易造成氣溶膠污染。因此，急需一種一步法快速分型鑒別方法來區分牛群中BVDV-1型和BVDV-2型感染，為疫病防控提供技術支持。

發明內容

針對上述背景技術中指出的不足，本發明根據BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因組序列5'-UTR序列設計一組(4條)特異性引物，提供了一種用于牛病毒性腹瀉病毒分型的一步法雙重RT-PCR檢測方法，旨在解決上述背景技術中現有技術存在的問題。

本發明采用以下技術方案：

一種用于牛病毒性腹瀉病毒分型的一步法雙重RT-PCR檢測方法，該方法包括以下步驟：

(1)引物設計與合成

根據BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因組序列5'-UTR序列設計4條特異性引物，所述引物的基因序列如下：

BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，

P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，

BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，

P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3',

(2)樣品處理及核酸提取

采集牛腹瀉糞便和血清樣品若干份，使用核酸提取試劑盒提取樣品的核酸RNA；

(3)陽性質粒的制備

以BVDV-1和BVDV-2基因組5'端非編碼區(5'-UTR)分別為目的序列，與pMD19-T 載體進行重組質粒的構建；