[發明專利]一種用于牛病毒性腹瀉病毒分型的一步法雙重RT-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202110071124.9
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN113174446A
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 歐云文;王勤;劉俐君
• 申請（專利權）人: 開江縣動物疫病預防控制中心;達州職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京興智翔達知識產權代理有限公司 11768
• 代理人: 郭衛芹

1.一種用于牛病毒性腹瀉病毒分型的一步法雙重RT-PCR檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)引物設計與合成

根據BVDV-1型和BVDV-2型流行毒株全基因組序列5'-UTR序列設計4條特異性引物，所述引物的基因序列如下：

BVDV-1型：P1：5'-GCCTAGGGAACGAAT-3'，

P2：5'-TGCAGCACCCTATCAG-3'，

BVDV-2型：P3：5'-GGCAACGTAGGGAAC-3'，

P4：5'-TGGCATCTCGAGACTC-3'，

(2)樣品處理及核酸提取

采集牛腹瀉糞便和血清樣品若干份，使用核酸提取試劑盒提取樣品的核酸RNA；

(3)陽性質粒的制備

以BVDV-1和BVDV-2基因組5'端非編碼區(5'-UTR)分別為目的序列，與pMD19-T載體進行重組質粒的構建；

(4)RT-PCR擴增反應

以P1、P2、P3、P4為引物，對構建的重組質粒進行RT-PCR擴增，RT-PCR擴增反應體系為：2×One step buffer緩沖液10μL、One step Enzyme Mix混合液0.5μL、10mmol/L引物P1 0.5μL、10mmol/L引物P2 0.5μL、10mmol/L引物P3 0.5μL、10mmol/L引物P4 0.5μL、模板1.0μL、補加雙蒸水至20μL；擴增程序為：50℃反轉錄30min；95℃預變性5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；進行30個循環；72℃延伸10min；擴增產物于1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收目的片段，測序并分析特異性。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：當擴增片段大小為279bp，則樣本中的牛病毒性腹瀉病毒為牛病毒性腹瀉病毒1型；當擴增片段大小為180bp，則樣本中的牛病毒性腹瀉病毒為牛病毒性腹瀉病毒2型；當擴增片段同時出現279bp和180bp大小，則樣本為牛病毒性腹瀉病毒1型和2型混合感染。