[發(fā)明專利]一種利用LAMP技術(shù)快速檢測傷寒沙門氏菌的引物組、檢測方法、試劑盒有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110070992.5 | 申請日： | 2021-01-19 |
| 公開（公告）號： | CN112725480B | 公開（公告）日： | 2022-10-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 劉洪濤;葉誠;曹亞楠;鄭軍平;胡海明;楊化冰;張志剛;殷明珠 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢海關(guān)技術(shù)中心 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42 |
| 代理公司： | 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401 | 代理人： | 楊采良 |
| 地址： | 430000 湖北*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 利用 lamp 技術(shù) 快速 檢測 傷寒 沙門氏菌 引物 方法 試劑盒 | ||
本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用LAMP技術(shù)快速檢測傷寒沙門氏菌的引物組、檢測方法、試劑盒。本發(fā)明選用沙門菌毒力基因SirA(U88651.1)，該基因作為控制鼠傷寒沙門氏菌腸道致病毒力功能的主要調(diào)節(jié)基因，具有增強沙門菌致病島中的hilA和prgH毒力基因表達的功能，所以選擇其作為特異性靶標，設(shè)計了4條能在62?68℃下擴增該基因的特異性引物組，通過HNB染料指示檢測結(jié)果，由紫羅蘭色(陰性)變?yōu)樘焖{色(陽性)，該方法檢測沙門菌其特異性好、操作簡單，無需昂貴儀器，且靈敏度比常規(guī)PCR高。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用LAMP技術(shù)快速檢測傷寒沙門氏菌的引物組、檢測方法、試劑盒。
背景技術(shù)
傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)是一種常見的食源性致病菌，包含多種常見血清型，屬于沙門氏菌中毒力最強的致病菌。傷寒沙門氏菌中毒的癥狀主要以急性腸胃炎為主，潛伏期一般為四至四十八小時，短期是數(shù)小時，長期是兩天至三天；前期癥狀有惡心、頭疼，全身乏力和發(fā)冷等，主要癥狀有嘔吐、腹瀉、腹疼，糞便以黃綠色水樣便，有時帶膿血和黏液，一般發(fā)熱的溫度在三十八攝氏度至四十攝氏度，重病人出現(xiàn)打寒戰(zhàn)、驚厥、抽搐和昏迷的癥狀。傷寒發(fā)病率在我國食源性疾病中占比較高，每年近十萬人感染此病菌，對食品中傷寒沙門氏菌進行精準檢測是保障食品安全和指導細菌治療的重要手段。
目前針對食源性致病菌的檢測主要有培養(yǎng)鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附法、PCR分析法。細菌培養(yǎng)法是病原菌檢測的金標準，但需4-7天出結(jié)果，操作繁瑣、耗時費力，在敏感性與特異性方面存在局限性，只能檢測活細菌，且需要熟練操作經(jīng)驗。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)在特異性方面較好，但依賴于酶標儀等專業(yè)設(shè)備。各種PCR技術(shù)主要通過DNA提取、PCR擴增、電泳觀察或者熒光曲線等分析病原菌，檢測敏感、準確、迅速，但仍依賴昂貴的PCR儀，檢測成本較高，對實驗技術(shù)要求較高，難以勝任現(xiàn)場化便攜式快速檢測。環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是一種新的等溫核酸擴增方法，該法針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應(yīng)。該技術(shù)具有PCR儀非依賴性、檢測結(jié)果可視化、反應(yīng)時間短、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，特別適合病原微生物的檢測。
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種利用LAMP技術(shù)快速檢測傷寒沙門氏菌的引物組、檢測方法、試劑盒，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題或至少緩解現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種利用LAMP技術(shù)快速檢測傷寒沙門氏菌的引物組，序列為：
SirA-3F3：CCCGATCGACAGCGGATA
SirA-3B3：CAATCTGACTGAGCGCCAT
SirA-3FIP：GAGATAGCCAGCTGCGCCAGCTGACCGTCCATACGGAGAA
SirA-3BIP：CTCAGGAGGTGGTGAGCGCTCTGTTGAGCGATATCGGAGG
所述引物組靶向序列為SirA(U88651.1)基因。
本發(fā)明還披露了一種傷寒沙門氏菌特異性LAMP可視化檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1中所述的引物組。
進一步地，還包括2×LAMP緩沖液、Bst 2.0Warmstart DNA聚合酶，10mM dNTPs，5MPCR級甜菜堿，20×Eva Green，120μM HNB。
還可以包括陰性對照和/或陽性對照，所述陰性對照為PUC57空載體質(zhì)粒，所述陽性對照為插入了傷寒沙門氏菌sirA基因的PUC57載體。所述陽性對照為沙門菌標準菌株ATCC13076，ATCC14028，D68-4。
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