[發(fā)明專利]檢測菜豆莢斑駁病毒的交叉引物擴(kuò)增引物組、試劑盒及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110069957.1
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112725530A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊倩倩;王道;俞曉平;張蓬軍;孫凱;劉光富;尹傳林
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 鄭海峰

本發(fā)明公開了一種檢測菜豆莢斑駁病毒的交叉引物擴(kuò)增引物組、試劑盒及應(yīng)用。針對檢測菜豆莢斑駁病毒存在的問題，本發(fā)明涉及并篩選了具有高特異性的檢測菜豆莢斑駁病毒的交叉引物擴(kuò)增引物組，并進(jìn)一步涉及了試劑盒和檢測方法。本發(fā)明提供的試劑盒和方法特異性好，對南方菜豆花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、南芥菜花葉病毒、煙草環(huán)斑病毒等都呈陰性反應(yīng)；靈敏度高，實(shí)時熒光檢測方法最低可以檢測到5x10^?3ng/μl菜豆莢斑駁病毒RNA模板，核酸試紙條檢測方法最低可以檢測到5x10^?2ng/μl菜豆莢斑駁病毒RNA模板。非常適用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全以及進(jìn)出口檢疫的現(xiàn)場檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大豆種傳檢疫性病毒菜豆莢斑駁病毒的交叉引物擴(kuò)增快速檢測試劑盒及應(yīng)用

技術(shù)背景

菜豆莢斑駁病毒是(bean pod mottle virus，BPMV)是豇豆花葉病毒科(Comoviridae，豇豆花葉病毒屬(Comovirus)成員。1948年，菜豆莢斑駁病毒首次被報道在菜豆上發(fā)現(xiàn)，后蔓延至加拿大、巴西、秘魯、厄瓜多爾和伊朗等大豆產(chǎn)區(qū)。菜豆莢斑駁病毒的寄主局限于豆科植物，大豆、菜豆是其多年生寄主。菜豆莢斑駁病毒在大豆上會表現(xiàn)出褪綠、斑駁、壞死等癥狀，破壞大豆品質(zhì)，造成大豆產(chǎn)量損失。菜豆莢斑駁病毒是危害大豆等豆科植物的重要病毒，在美國已引起大豆產(chǎn)量的巨大損失，我國尚無分布。鑒于菜豆莢斑駁病毒對菜豆生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅，其被我國列為中國進(jìn)境植物檢疫性病毒。我國是世界第一大豆進(jìn)口國，隨著我國大豆進(jìn)口數(shù)量不斷增加，該病毒隨大豆傳入的風(fēng)險逐步增大，為了保護(hù)我國大豆生產(chǎn)安全以及進(jìn)出口安全，需要建立一種快速準(zhǔn)確檢測菜豆莢斑駁病毒的檢測方法。

早期，菜豆莢斑駁病毒的檢測方法主要有寄主生物學(xué)癥狀檢測、電鏡觀察等。當(dāng)前菜豆莢斑駁病毒的檢測方法主要是以ELISA為主的血清學(xué)方法和以PCR及其衍生技術(shù)為主的分子生物學(xué)方法。ELISA方法檢出限低，難以實(shí)現(xiàn)無癥狀植物中少量病毒的檢測，且ELISA方法常常無法鑒別病毒種類，特異性差。PCR檢測方法廣泛應(yīng)用在植物病毒檢測領(lǐng)域，但是其需要復(fù)雜的熱循環(huán)儀器，存在反應(yīng)時間長等缺陷，難以滿足口岸檢疫的快速檢測的需求。

交叉引物恒溫擴(kuò)增(Cross-priming isothermal amplification，CPA)是杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司研發(fā)的恒溫擴(kuò)增技術(shù)，也是中國首個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)。根據(jù)反應(yīng)體系中交叉引物數(shù)量的不同，CPA可分為單交叉引物擴(kuò)增(single crossingcpa)和雙交叉引物擴(kuò)增(double crossing cpa)兩種類型。這兩種類型反應(yīng)都需要一條交叉引物(CPF)、兩條擴(kuò)增引物(DR、MBR)、兩條解開鏈的外圍引物(BF、BR)以及具有鏈置換活性的DNA聚合酶Bst。其中，雙交叉引物CPA具有兩條交叉引物，比單交叉引物CPA多一條交叉引物。單交叉引物擴(kuò)增CPA是在對雙交叉引物CPA機(jī)制優(yōu)化后誕生的，其能夠在不到一小時的時間內(nèi)擴(kuò)增出4個基因組DNA拷貝，具有高度的特異性，也是目前被廣泛引用的交叉引物擴(kuò)增技術(shù)。CPA自誕生起，其主要應(yīng)用于肺結(jié)核分枝桿菌的檢測，進(jìn)行肺結(jié)核病的診斷。目前優(yōu)思達(dá)公司開發(fā)了結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(TB-CPA)，具有較高的靈敏度和特異度，可以在2h內(nèi)完成檢測并出具報告，適用于基層醫(yī)院和衛(wèi)生所。此外，CPA在食品安全領(lǐng)域也開展了研究如轉(zhuǎn)基因作物檢測(Huang,et al.2014)、食源性致病菌李斯特菌的檢測；在動物檢疫領(lǐng)域建立了結(jié)合試紙條的非洲豬瘟檢測方法(Fraczyk,et al.2016)，在植物檢疫性領(lǐng)域建立了李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)和黃瓜綠斑駁花葉病毒(GGMMV)的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對檢測菜豆莢斑駁病毒存在的問題，提供了一種菜豆莢斑駁病毒的交叉引物擴(kuò)增快速檢測試劑盒及引物，該試劑盒具有高特異性、高靈敏度、操作簡單、檢測快的特點(diǎn)。

本發(fā)明首先公開了一種檢測菜豆莢斑駁病毒的交叉引物擴(kuò)增引物組，所述交叉引物擴(kuò)增引物組由外圍置換引物BPBF、外圍置換引物BPBR、擴(kuò)增引物BPDR、擴(kuò)增引物BPMBR、交叉引物BPCPF組成；