[發明專利]一種檢測成纖維細胞活化蛋白的生物發光探針、及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110069909.2
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112898293B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 張玲;陳二超;盛志佳;薛運生;鄭友廣
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: C07D417/14
• 分類號: C07D417/14;C09K11/06;G01N21/76
• 代理公司: 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

本發明涉及一種檢測成纖維細胞活化蛋白的生物發光探針、及其制備方法和應用。本發明提供的識別FAP的生物發光探針BL?FAP，具有選擇性好、靈敏度高、檢測限低及良好生物相容性的優點。在Tris?HCl緩沖液中，生物發光強度與成纖維細胞活化蛋白濃度(0?0.2mg/mL)呈現良好的線性關系，說明探針適合定量檢測成纖維細胞活化蛋白；探針BL?FAP能夠檢測MGC?803?luc細胞表達的FAP；進一步該探針檢測到了裸鼠移植瘤模型中腫瘤組織內的FAP水平；并應用該探針檢測健康成人、胃部良性病變和胃癌患者血漿中FAP酶活水平，結果提示胃癌患者血漿中FAP的酶活水平顯著高于健康成人和胃部良性病變患者。

技術領域

本發明屬于有機合成及分析檢測領域，具體涉及一種檢測成纖維細胞活化蛋白的生物發光探針、及其制備方法和應用。

背景技術

成纖維細胞活化蛋白(Fibroblast activation protein,FAP)主要存在于腫瘤相關成纖維細胞、間充質細胞和腫瘤細胞表面，是II型跨膜絲氨酸蛋白酶家族的一員，具有二肽肽酶和膠原酶活性。FAP在多種癌癥中高度上調，表達于90％以上的上皮惡性腫瘤，通常作為促腫瘤基質生長的標志物。

腫瘤生長環境中存在著大量腫瘤因子，這些腫瘤因子可以誘導FAP上調，上調的FAP 可以激活生長因子，促進血管生成、腫瘤生長及浸潤；同時，由于FAP具有膠原酶活性，可以水解細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)中的膠原，從而破壞ECM，促進腫瘤的侵襲和轉移。綜上所述，FAP可以直接促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲；與FAP高表達細胞共培養也能促進腫瘤、內皮細胞和免疫細胞的增殖、活化和侵襲。

目前檢測成纖維細胞活化蛋白的方法，主要包括酶聯免疫吸附法、免疫熒光法、免疫組化法和小分子探針技術。其中，小分子探針技術具有高靈敏度、無損快速分析和實時監測等優勢，可實現FAP的可視化、原位檢測。

生物發光成像(Bioluminescence imaging)是生物體內一種由化學反應產生的特殊可見發光現象，主要是指在酶的催化作用下生物能轉變成光能的過程，而該過程不依賴于有機體對光的吸收。最常見的生物發光體系是螢火蟲螢光素酶-螢光素體系，其發光原理是螢光素在O₂、ATP、Mg²⁺等輔因子作用下，被螢光素酶催化氧化，發生電子躍遷，分子由激發態回到基態時產生光子，從而發出黃綠色的可見光，以及釋放出氧化螢光素、CO₂和AMP的過程。生物發光成像具有特異性強、信噪比高、靈敏度高、適合活體成像的優勢。2019年，Li課題組制備了首個識別FAP的生物發光探針Probe 1、2，結構式如下，其中Probe 1顯示出對FAP更好的選擇性，檢測限為0.254ng/mL，Probe 2的檢測限為0.419 ng/mL。應用Probe 1實現了FVB-luc⁺轉基因小鼠和荷瘤裸鼠中FAP水平的可視化檢測。此外，該探針也成功用于監測博萊霉素誘導的特發性肺纖維化小鼠肺勻漿中FAP的水平。

如何高選擇性識別FAP，是該類探針開發的技術難點。DPP IV是FAP的同工酶，具有50％的同源性，是檢測FAP過程中影響最大的干擾物之一。Li報道的探針Probe 1與相同濃度的FAP和DPP IV孵育后，兩者產生的生物發光信號僅相差1個數量級。因此，檢測FAP探針的選擇性還需要進一步提高，迫切需要開發出具有高選擇性、高信噪比、高靈敏度的FAP可視化檢測方法。

發明內容

本發明的目的是在現有技術的基礎上，提供一種用于檢測成纖維細胞活化蛋白的生物發光探針，該探針能夠定量的檢測成纖維細胞活化蛋白，檢測限可達18.1pg/mL，表明該探針具有較高的檢測靈敏度，并且對FAP具有較高的選擇性。

本發明的另一目的是提供一種上述生物發光探針制備方法。

本發明的又一發明目的是提供上述生物發光探針在成纖維細胞活化蛋白檢測中的應用。