[發(fā)明專利]提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突變體及其編碼基因和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110066370.5
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112574978B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖志壯;方安然;孫建飛;于文君;付五兵;王金龍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島尚德生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56;C12N15/57;C12N15/10
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發(fā)明提供了提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突變體及其編碼基因和應用。本發(fā)明通過使用易錯PCR方法對Bacillus licheniformis來源的蛋白酶基因進行改造，再通過篩選得到單點突變的蛋白酶突變體APR01，并在此基礎(chǔ)上，利用第二輪易錯PCR，篩選獲得了兩個含有兩個點突變的蛋白酶突變體APR02和APR03，以及一個含有三個點突變的蛋白酶突變體APR04。本發(fā)明的突變體的降解醇溶蛋白的能力得到明顯的提高，能夠增加其對醇溶蛋白的降解率，因此具有良好的市場應用前景和工業(yè)價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突變體及其編碼基因和應用。

背景技術(shù)

蛋白酶是催化水解蛋白質(zhì)中肽鍵的一類酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，有著許多不同的生理功能，是酶學研究開展的較早，也是最為成熟的一種。蛋白酶在各個領(lǐng)域中的應用愈加廣泛，例如食品工業(yè)、釀酒釀造、洗滌劑行業(yè)、飼料工業(yè)、制革工業(yè)、絲綢行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等，與我們的生活息息相關(guān)，這種環(huán)境下對蛋白酶的產(chǎn)量和特性改良方面都提出了更高的要求。

醇溶蛋白是植物種子儲存蛋白的組分之一，不溶于水，可溶于60%～95%的乙醇溶液。醇溶蛋白是谷物蛋白粉中含量較高的蛋白質(zhì)，玉米、小麥、高粱等原料在飼料行業(yè)中大量使用，其中，玉米中醇溶蛋白約占蛋白總量的65%，小麥醇溶蛋白醇約占蛋白總量的40%，高粱醇溶蛋白醇約占蛋白總量的77-82%。醇溶蛋白由于其獨特的性質(zhì)不能被內(nèi)源酶消化，大大降低了飼料蛋白利用率，影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟效益，同時未消化的蛋白經(jīng)畜禽糞尿排放到環(huán)境中還會造成環(huán)境氮污染。

易錯PCR技術(shù)是在采用DNA聚合酶進行PCR反應擴增目的片段時，通過調(diào)整反應條件，增加擴增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，構(gòu)建突變體文庫，從而篩選需要的正向突變體。易錯PCR技術(shù)可以很好地應用于蛋白質(zhì)的分子改造中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突變體及其編碼基因和應用。本發(fā)明通過構(gòu)建突變體文庫和定向篩選的方法，對Bacillus licheniformis WX-02來源的蛋白酶基因進行改良，篩選得到對醇溶蛋白降解率提高的突變體，有助于提升飼料蛋白質(zhì)的利用率，提高經(jīng)濟效益，減少環(huán)境污染。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突變體APR01，所述蛋白酶突變體APR01的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述蛋白酶突變體APR01是由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的蛋白酶的第234位的絲氨酸變?yōu)樯彼岖@得的。

本發(fā)明還提供了所述的蛋白酶突變體APR01的編碼基因，所述蛋白酶突變體APR01的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本發(fā)明還提供了一種提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突變體APR02，所述蛋白酶突變體APR02的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述蛋白酶突變體APR02是由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的蛋白酶的第234位的絲氨酸變?yōu)樯彼幔约暗?63位的絲氨酸變?yōu)楫惲涟彼岖@得的。

本發(fā)明還提供了所述的蛋白酶突變體APR02的編碼基因，所述蛋白酶突變體APR02的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本發(fā)明還提供了一種提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突變體APR03，所述蛋白酶突變體APR03的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述蛋白酶突變體APR03是由氨基酸序列為SEQ ID NO：1的蛋白酶的第234位的絲氨酸變?yōu)樯彼幔约暗?64位的甘氨酸變?yōu)樯彼岖@得的。

本發(fā)明還提供了所述的蛋白酶突變體APR03的編碼基因，所述蛋白酶突變體APR03的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。