[發明專利]一種動物血液連續分離方法

在審

• 申請號: 202110065819.6
• 申請日: 2021-01-19
• 公開（公告）號: CN112522252A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 任春陽;謝羽絨
• 申請（專利權）人: 南京澤維爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N9/02
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 蔣真

1.一種動物血液連續分離方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.采血：收集動物血液并加入抗凝劑；

S2.血液分管：將S1處理后的血液分別加入兩組試管中，得第一血液、第二血液；

S3.提取動物血液中的DNA；

S4.提取動物血液中的超氧化物歧化酶；所述S1中的抗凝劑的制備方法包括以下步驟：

步驟一、分別量取肝素鈉和蒸餾水，然后將肝素鈉充分溶于蒸餾水中，得抗凝劑母液；

步驟二、用1ml注射器稀釋所述抗凝劑母液，得待烘抗凝劑稀釋液；

步驟三、用所述1ml注射器向5ml注射器內定量注入所述待烘抗凝劑稀釋液；

步驟四、將裝有所述待烘抗凝劑稀釋液的所述5ml注射器在35-65℃下烘干，得抗凝劑；所述步驟二具體為：先用蒸餾水將所述抗凝劑母液稀釋，然后用1ml注射器定量吸取稀釋后的所述抗凝劑母液，再吸取蒸餾水至1ml，得所述待烘抗凝劑稀釋液；所述步驟三之后、所述步驟四之前還包括：旋轉所述5ml注射器，使所述待烘抗凝劑稀釋液均勻附著于所述5ml注射器的管壁之上；所述S3種提取動物血液中的DNA的具體步驟包括：

步驟一、取第一血液；

步驟二、血液稀釋：在第一血液樣本中加入KCl溶液，第一血液與KCl溶液的體積比為1：5，顛倒混勻；

步驟三、去除紅細胞：向步驟二中的溶液中加入與第一血液體積相同的甲醇-乙酸混合液，顛倒混勻，離心棄上清，得到殘留細胞團；向細胞團中加入5倍第一血液體積的甲醇-乙酸混合液，吹散混勻，離心棄上清，重復2-3次，直至上清液變無色；

步驟四、裂解白細胞沉淀蛋白：將得到的細胞團轉入2ml微量離心管中，加入適量的雙蒸水混勻，離心棄上清，加入細胞裂解液0.5ml、12μl濃度為222mg/ml的蛋白酶K，60℃孵育4小時；再加入120μl6M的乙酸銨混勻、離心；所述細胞裂解液是0.02M Tris-HCl、1.2mMEDTA、1.5％SDS的混合液；

步驟五、分離純化DNA：用無水乙醇沉淀DNA，并用72％乙醇洗滌沉淀；所述步驟五分離純化DNA是吸取0.4ml上清液，加入2倍體積的預冷無水乙醇，輕輕混勻，待出現絮狀沉淀后，離心棄上清；再加入1.5ml 72％乙醇洗滌沉淀，離心棄上清；干燥沉淀，加入25-55μl TE溶解DNA。

2.根據權利要求1所述的一種動物血液連續分離方法，其特征在于：所述S4中提取動物血液中的超氧化物歧化酶的具體包括以下步驟：

步驟一、取第二血液；

步驟二、血液分離：向第二血液中加入質量濃度為4-14％的檸檬酸鈉溶液，檸檬酸鈉溶液的體積為第二血液體積的4-12％，經抗凝處理后再經離心機離心收集得到紅細胞，泵入水解反應罐；

步驟三、溶血破碎細胞：向步驟二收集的紅細胞中加入1-3倍體積的純凈水，使紅細胞完全破碎，得紅細胞溶血液；

步驟四、熱變性：將紅細胞溶血液加熱至60℃保溫10-30分鐘后，再向紅細胞溶血液中加入用以提高溶液的離子強度的堿金屬鹽，至堿金屬鹽濃度為0.1-0.5mol/L，繼續加熱至70℃，保溫30-50分鐘后，再升溫至77-80℃，保溫12-25分鐘，立即放料冷；

步驟五、壓濾：用800目濾布對經步驟四處理的紅細胞溶血液進行機械壓濾，濾液為SOD粗提液；

步驟六、超濾濃縮：SOD粗提液先經超濾膜預處理攔截分子量大于100萬的大分子蛋白和細胞膜碎片，然后經截留分子量8000孔徑的超濾膜反復超濾，去除水分、無機鹽和小分子雜蛋白，直至濃縮到SOD粗提液體積的2％-14％，即為SOD濃縮液；

步驟七、沉淀除雜蛋白：向步驟六所得的SOD濃縮液中加入金屬鹽，至該金屬鹽濃度為1-5mmol/L，攪拌均勻后靜置沉淀，離心去沉淀，上清液經超濾脫鹽后獲得SOD粗品，獲得的SOD粗品經離子交換層析后再經分子篩層析后獲得SOD精品。

3.根據權利要求2所述的一種動物血液連續分離方法，其特征在于：所述步驟四中的堿金屬鹽為堿金屬的氯化物中的一種或幾種的混合物。

4.根據權利要求2所述的一種動物血液連續分離方法，其特征在于：所述步驟七中的金屬鹽為銅鹽或鋅鹽中的一種或幾種的混合物。

5.根據權利要求2所述的一種動物血液連續分離方法，其特征在于：所述步驟二中離心機的控制系統采用的數學模型有：靜態模型、動態模型、離散模型、連續模型、幾何模型、微分方程模型、圖論模型、規劃論模型、馬氏鏈模型，且所述離心機的控制系統采用的數學公式有：牛頓-萊布尼茨公式、貝葉斯公式；

所述牛頓-萊布尼茨公式為：

；

所述貝葉斯公式為：

。