[發明專利]一種基于P53突變篩選腫瘤類器官的培養方法

在審

• 申請號: 202110065540.8
• 申請日: 2021-01-18
• 公開（公告）號: CN113186163A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 楊光;周正;牛建軍;劉平果;張以平
• 申請（專利權）人: 南昌五元生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發明涉及類器官培養技術領域，具體公開了一種基于P53突變篩選腫瘤類器官的培養方法。本發明的培養方法包括以下步驟：S1.解凍未經處理的腫瘤類器官以產生細胞懸浮液，將細胞懸浮液加入至基礎培養基中混勻離心，除上清液，得腫瘤類器官混合物；S2.加入基質膠重懸腫瘤類器官混合物，重懸后將類器官混合物接種至含有y27632的類器官培養基中進行培養；S3.當腫瘤類器官混合物第一次換液后，吸除類器官培養基，然后加入含有Nutlin3A的培養基進行持續培養。本發明培養方法成本價格低，無需進行測序，在腫瘤類器官培養早期節省了檢測成本，又實現了精準簡化地培養腫瘤類器官。

技術領域

本發明涉及類器官培養技術領域，尤其是涉及一種基于P53突變篩選腫瘤 類器官的培養方法。

背景技術

目前，隨著靶向藥物研究的持續深入，多種靶向特定致癌基因的藥物不斷 進入臨床，給廣大患者帶來了福音。然而，由于癌癥的本質是受多基因突變影 響的疾病，患者腫瘤會隨著疾病的進展而不斷演化，導致形成患者間的腫瘤異 質性和同一腫瘤內的異質性。癌癥異質性給靶向精準治療增加了不確定性，同 時也是導致癌癥藥物治療耐藥性的重要原因之一。為此，拓展針對癌癥異質性 的精準醫療具有重要的現實意義，而腫瘤類器官技術的興起則為此提供了全新 的更加有效的應用平臺。

類器官是將具有成體干細胞潛能的細胞或組織在體外進行3D培養而成的 三維微觀結構。基于患者腫瘤組織的類器官培養被稱為腫瘤類器官培養。腫瘤 類器官具備自主生長及更新的能力，并且可以保留腫瘤組織特點和一定的遺傳 穩定性，因此與傳統二維培養的腫瘤細胞系相比，腫瘤類器官具有更高的臨床 相關性和個體多樣性，是目前最接近臨床狀況的體外腫瘤疾病模型。在技術應 用上，腫瘤類器官疾病模型不僅在癌癥的精準醫療上可用于指導患者用藥的選 擇，同時在抗癌藥物研發中，基于保有患者癌癥異質性的標本庫的建立，腫瘤 類器官模型可更有效的評估臨床前或臨床試驗中的先導化合物針對特定類型癌 癥的藥效。腫瘤類器官已成為腫瘤基礎研究中既模擬腫瘤生長的“環境”又具有患 者特異性(優于實驗動物模型)的最佳疾病模型，為臨床研究和治療中“有測序無 靶點，有靶點無藥物，有藥物無療效”的困境帶來了曙光。正因為腫瘤類器官能 夠保留原始腫瘤的性質，從而通過對腫瘤類器官的藥物測試，可為腫瘤來源的 病人選取考慮其癌癥異質性的治療方案，由此促進了癌癥精準治療的進一步研 究和發展。然而，腫瘤類器官的培養技術面臨著一些未知和挑戰。挑戰之一， 腫瘤組織中往往混雜著正常組織，如選擇的培養基不正確，隨著傳代培養，源 自正常組織的類器官會逐漸替代腫瘤類器官，導致所培養的腫瘤類器官群體逐 漸喪失腫瘤特性，使得針對腫瘤類器官的藥敏測試得出非患者實際腫瘤狀況的 實驗數據，對臨床用藥產生誤導，以致延誤患者選擇精準有效藥物的時間。

目前，多種方法已經用于應對上述挑戰。以腫瘤腫瘤類器官為例，基于腫 瘤類器官在物理特性、細胞特性、腫瘤特有基因突變方面同正常類器官的區別， 研究者采用過四種對腫瘤類器官進行特異性篩選的培養方法，但這些方法均存 在著操作繁瑣或對實驗室要求很高等明顯限制因素。第一種方法是在培養過程 中人工操作處理，即在顯微鏡下使用工具剔除無“癌癥類器官特征”、表型“正常” 的類器官，該方法可行性低、錯誤率高；第二種方法是利用流式細胞儀將腫瘤 組織細胞中的癌癥干細胞分選提取，利用篩選出的高純度的特定腫瘤細胞進行 類器官培養，該方法不僅對硬件要求高，同時也存在所選特定癌細胞無法反映 患者主要腫瘤性質的風險；第三種方法是根據已知的患者測序結果，調整培養基成分，篩選顯示特定的癌癥相關突變表型的類器官，該方法的問題是患者測 序結果的獲得往往滯后于腫瘤類器官的起始培養時間；第四種方法是通過對培 養獲取的腫瘤類器官進行測序來確定是否有與患者癌癥相關的突變，該方法存 在成本高和效率低的問題。