[發明專利]一種膠乳增強競爭免疫比濁檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110064759.6
• 申請日: 2021-01-18
• 公開（公告）號: CN112946254A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 吳馮波;林巍靖;劉斌虎
• 申請（專利權）人: 上海云澤生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/577;G01N33/53
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 王衛彬;黃益澍

本發明公開了一種用于改善膠乳增強競爭免疫比濁分析靈敏度的方法以及基于該方法的檢測試劑盒。本發明利用生物素對抗體的多重標記和生物素?親合素之間的結合反應，可以使用微量的BLAAA建立膠乳增強競爭免疫比濁分析方法，顯著改善檢測敏感性。

技術領域

本發明屬于生化檢測領域，具體涉及一種膠乳增強競爭免疫比濁檢測方法及試劑盒。

背景技術

膠乳增強免疫比濁檢測(Latex enhanced turbidimetric immunoassay，LETIA)是一種經典的免疫檢測方法，它將抗體或抗原偶聯于納米尺寸的膠乳微球表面，利用抗體-抗原間高度特異性的結合，使膠乳微球表面的抗體或抗原與標本所含的待測物反應而形成微球聚集體，進而使免疫反應體系在特定波長下的吸光度發生變化，通過測定該變化計算標本中待測物的濃度。迄今，LETIA在臨床醫學中已得到廣泛應用，涉及腫瘤、風濕、肝功能、腎功能和藥物濃度監測等諸多領域。然而，盡管LETIA已廣泛應用于常規臨床分析，但由于該方法較低的分析靈敏度，以LETIA準確定量標本中含量極低的待測物濃度，仍然是一個挑戰。

膠乳增強競爭免疫比濁檢測是LETIA的一種實施方式，其通過標本所含待測物與檢測體系固定量的待測物競爭結合限量的抗待測物抗體實現對待測物的定量，常用于小分子待測物的檢測，如：地高辛、他克莫司(Tacrolimus)、環孢素、甲胺喋呤、伊馬替尼、黃曲霉素、克倫特羅和蘇丹紅，等。

被本領域技術人員所熟知的用于小分子待測物檢測的增強競爭免疫比濁檢測通常采用待測物小分子偶聯微球直接法和抗體偶聯微球直接法兩種模式，其原理分別示于圖1-B及圖1-C。

在待測物小分子偶聯微球直接法模式中(圖1-B)，標本所含待測物小分子與偶聯于微球表面的待測物小分子競爭結合限量的抗待測物抗體，當標本中不含待測物時，抗體可通過其二個結合位點橋聯二個不同的微球，從而引發凝集；當標本中含有待測物時，抗體結合位點被待測物占據，膠乳微球的凝集受到抑制。該模式下，抗體的兩個結合位點均與同一膠乳微球表面的二個待測物分子結合的那部分抗體，將失去橋聯兩個膠乳微球的能力，從而無法引發凝集。盡管經過充分的工藝優化，本發明人采用此模式建立的他克莫司LETIA，其可獲得的他克莫司最高靈敏度僅約6.9ng/mL。

抗體偶聯微球直接法(圖1-C)需要先將小分子與蛋白質或其它載體偶聯，制備載體-小分子復合物，使單一載體分子上含有多個小分子；由于載體-小分子復合物和抗體-膠乳微球的多價性，在適當的條件下載體-小分子復合物與抗體-膠乳微球很容易引發凝集，而標本中的小分子待測物通過占據膠乳微球表面的抗體結合位點而抑制這種凝集反應，根據凝集反應的被抑制程度，可定量標本中的小分子待測物濃度。本發明人采用此模式研制了人全血他克莫司膠乳增強競爭免疫比濁檢測試劑(CFDA注冊證號:20192400305)，盡管其具有優良的檢測準確性，可獲得的他克莫司LOD(檢測下限，Limit of Detection)僅約1.0ng/mL。1.0ng/mL的LOD對于大多數他克莫司臨床監測已足夠靈敏，但對于聯合免疫抑制用藥的器官移植患者(A comparative,randomized trial of concentration-controlledsirolimus combined with reduced-dose tacrolimus or standard-dose tacrolimusin renal allograft recipients.Transplantation Proceedings,2013，45,2133-2140)和某些使用低劑量他克莫司治療的自身免疫性疾病患者(Changes in the blood level,efficacy,and safety of tacrolimus in pregnancy and the lactation period inpatients with systemic lupus erythematosus.Lupus.2018，27:2245-2252)，進一步改善其檢測靈敏度將有助于更準確地檢測這些患者血液中的低濃度藥物。