[發(fā)明專利]G418發(fā)酵液的精制純化工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110060711.8
• 申請日: 2021-01-18
• 公開（公告）號: CN112724182B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 任兆龍;王福聚;李婷婷
• 申請（專利權(quán)）人: 北京泛球生物科技有限公司
• 主分類號: C07H1/06
• 分類號: C07H1/06;C07H15/232
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發(fā)明提供一種G418發(fā)酵液的精制純化工藝，用草酸調(diào)節(jié)G418發(fā)酵液pH至2.0?3.0，然后加入助濾劑，充分?jǐn)嚢瑁俳?jīng)板框過濾、得到G418溶液；然后將G418溶液依次經(jīng)陶瓷膜過濾、陽離子交換樹脂吸附、陰離子交換樹脂脫色、大孔吸附樹脂吸附、真空濃縮、活性炭脫色和干燥即得G418純品。本工藝操作步驟簡單，產(chǎn)品純度高，可實現(xiàn)G418穩(wěn)定、安全高效地生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，具體地說，涉及G418發(fā)酵液的精制純化工藝。

背景技術(shù)

G418(Geneticin，遺傳霉素)是由棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora)、絳紅色小單孢菌(Micromonospora purpurea)或紅橙小單孢菌(Micromonosporarhodorangea)發(fā)酵產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，在分子遺傳試驗中，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601，Tn5的基因而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動物細(xì)胞，也包括原生動物和蠕蟲。當(dāng)Neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后，則能啟動Neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。G418的這一選擇特性已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得到廣泛應(yīng)用。G418有殺菌作用，本身有很好的殺菌效果，在用G418進(jìn)行篩選的過程中很少會發(fā)生污染。

棘孢小單孢菌、絳紅色小單孢菌或紅橙小單孢菌發(fā)酵液中主要產(chǎn)物是G418，但還含有多種氨基糖苷類雜質(zhì)成分，包括慶大霉素B、西索米星、小諾霉素和慶大霉素C等系列組分。這些雜質(zhì)的理化性質(zhì)與G418近似，都是水溶性很強的氨基糖苷類抗生素，因此制備高純度G418極其困難，US3997403中采用兩步陰陽離子樹脂交換，得到G418產(chǎn)品，但純度僅90％左右。WO/2012/079039中采用硅膠層析，得到G418純度達(dá)到95％以上的產(chǎn)品，生產(chǎn)成本較高。隨著對氨基糖苷類產(chǎn)品提純方法的不斷研究，涌現(xiàn)出許多新的純化技術(shù)，如泡沫分離法、反膠束萃取法、沉淀法和膜分離法等，但上述方法目前僅限于實驗室研究，難以實現(xiàn)對G418發(fā)酵液的大規(guī)模純化制備。此外，由于缺少G418成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)廠家生產(chǎn)的成品中G418有效含量較低，一般在90-92％；雜質(zhì)含量較高，嚴(yán)重影響了G418產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，亟需提供一種新的G418發(fā)酵液的精制純化工藝。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種G418發(fā)酵液的精制純化工藝。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的G418發(fā)酵液的精制純化工藝包括：用草酸調(diào)節(jié)G418發(fā)酵液pH至2.0-3.0，然后加入助濾劑，充分?jǐn)嚢瑁俳?jīng)板框過濾、得到G418溶液；然后將G418溶液依次經(jīng)陶瓷膜過濾、陽離子交換樹脂吸附、陰離子交換樹脂脫色、大孔吸附樹脂吸附、真空濃縮和活性炭脫色。

前述的方法，用草酸調(diào)節(jié)G418發(fā)酵液pH至2.0-3.0，攪拌2-3h后加入助濾劑。加入草酸使菌體破壁，同時使發(fā)酵液中的金屬離子和一些蛋白沉淀，增加上清液產(chǎn)品質(zhì)量。

前述的方法，加入助濾劑攪拌20-40min后再經(jīng)板框過濾。加入助濾劑有利于增加濾液流速。

所述助濾劑可以是硅藻土或珍珠巖，目數(shù)為40-100目，助濾劑的用量為G418發(fā)酵液體積的2-4％。

前述的方法，陶瓷膜過濾中選用多通道陶瓷膜，通道數(shù)控制在10-12。

優(yōu)選地，膜材質(zhì)為玻璃膜，孔徑為0.20μm。

陶瓷膜過濾時，將流速控制在5-10m/s，壓力控制在0.1-0.2MPa，濾液溫度控制在40-50℃。陶瓷膜能夠進(jìn)一步去除濾液中的不溶物，使上清液更加清澈透明。

前述的方法，陽離子交換樹脂可以去除絕大部分的蛋白、無機鹽、糖類和脂類等成分，陽離子交換樹脂吸附的方法如下：