[發(fā)明專利]一種總蛋白剛果紅染色作為內(nèi)參標準的免疫印跡定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110056963.3
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112881707B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許朝進;陳偉光;王俊靈;張佳佳
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 溫州名創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33258
• 代理人: 朱海曉

本發(fā)明屬于免疫印跡檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種總蛋白剛果紅染色作為內(nèi)參標準的免疫印跡定量檢測方法，包括以下步驟：（1）制備變性待測蛋白質(zhì)樣本；（2）通過凝膠電泳對待測蛋白質(zhì)樣本分離；（3）將步驟（2）電泳分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜上；（4）用剛果紅對步驟（3）轉(zhuǎn)印后的固相膜進行染色、脫色；（5）將步驟（4）染色后的固相膜進行免疫檢測;(6)運用分子模擬技術(shù)揭示被剛果紅染色的總蛋白作為內(nèi)參可能涉及到的機理。本發(fā)明評價了剛果紅染色后的免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)總蛋白剛果紅染色作為內(nèi)參標準，相比總蛋白麗春紅S染色及多種常用管家蛋白，其穩(wěn)定性、線性動力學(xué)范圍具有更為明顯的優(yōu)勢。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫印跡檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種總蛋白剛果紅染色作為內(nèi)參標準的免疫印跡定量檢測方法。

背景技術(shù)

蛋白免疫印跡（Western Blotting）是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種最常用的方法,如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。

免疫印跡法分三個階段進行.第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE):抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，遷移速度就越快.此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶).第二階段為電轉(zhuǎn)移:將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至固相膜上，選用低電壓(100V)和大電流(12A)，通電45min-1h左右轉(zhuǎn)移即可完成.此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見.第三階段為酶免疫定位:將印有蛋白質(zhì)條帶的固相膜(相當于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色.常用的HRP底物為3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍紫色).陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS-PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量。

在定量實驗中，需要有參考體系評估目標蛋白和總蛋白之間的關(guān)系，所以選擇一個合適的內(nèi)參是比較不同樣本中蛋白的關(guān)鍵。一個合格的內(nèi)參應(yīng)該具備以下幾種條件，第一，在不同樣本中恒定存在的內(nèi)參有利于樣本間的比較；第二，為了精確比較不同樣本間的免疫結(jié)果，常常通過標準化（即目標蛋白信號與內(nèi)參信號的比值）來矯正上樣誤差和轉(zhuǎn)膜誤差；第三，具有較寬的線性的范圍。目前常用的內(nèi)參主要有管家蛋白和總蛋白兩類。在免疫印跡分析中, 如β-actin（β-肌動蛋白），tubulin（微管蛋白）和GAPDH，被認為在生理病理狀態(tài)下具有一定的穩(wěn)定性，因此是最常用的管家蛋白。但是上述的幾種管家蛋白作為內(nèi)參標準時經(jīng)常會隨著不同細胞的狀態(tài)及組織類型而發(fā)生變化，而且,這些管家蛋白作為內(nèi)參標準也不適用于以下情況: 血清樣品, 胞外分泌物, 腦脊液以及純化蛋白的分析。總蛋白內(nèi)參法是采用將全部上樣蛋白染色后的灰度值作為體系內(nèi)參，目前研究多采用常見的具有較好的蛋白質(zhì)染色效果的試劑進行染色，但是存在不少缺陷，如麗春紅染色的敏感性較差，只有50-100ng；考馬斯亮藍會降低后續(xù)免疫反應(yīng)敏感性及改變抗原結(jié)構(gòu)；熒光染色有很好的敏感性但試劑貴且需要特殊的裝備。

剛果紅，化學(xué)名為:二苯基-4，4'-二(偶氮-2-)-1-氨基萘-4-磺酸鈉，分子式為C32H22N6Na2O6S2，為棕紅色粉末，溶于水呈黃紅色，溶于醇呈橙色。用于作為酸堿指示劑，變色范圍為3.5到5.2，堿態(tài)為紅色，酸態(tài)為藍紫色。也用于診斷淀粉樣病變。發(fā)明人在前期研究工作中（Wang J-L, Zhao L, Li M-Q, Chen W-G, Xu C-J. 2020. A sensitive andreversible staining of proteins on blot membranes. Anal Biochem. 592:113579.eng.）發(fā)現(xiàn)剛果紅對NC和PVDF膜上的蛋白質(zhì)染色迅速，其檢測靈敏度（約20 ng），較麗春紅S而言更靈敏。但是在Western Blotting中，被剛果紅染色后的總蛋白能否成為內(nèi)參標準，尚不明確，目前亦無文獻評估總蛋白剛果紅染色可作為均一化內(nèi)參在實驗室常見樣本中及蛋白上樣量的效果，而且剛果紅染色脫色后，固相膜上面免疫反應(yīng)的重復(fù)性和穩(wěn)定性也不清楚。