[發(fā)明專利]HBV PreS1多肽修飾的人肝細(xì)胞特異靶向性的rAAV2載體及其制備方法和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110055844.6
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112852879A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許瑞安;劉艷君;崔秀靈
• 申請（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;A61K48/00;A61P1/16;A61P35/00
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;秦彥蘇

本發(fā)明公開了HBV PreS1多肽修飾的人肝細(xì)胞特異靶向性的rAAV2載體及其制備方法和用途。本發(fā)明運(yùn)用同源重組法，將preS1多肽基因插入rAAV 2的衣殼質(zhì)粒，構(gòu)建得到改造質(zhì)粒；然后通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞對改造質(zhì)粒進(jìn)行包裝，再對病毒載體進(jìn)行純化以及檢測后，得到具有肝靶向性的改造病毒載體，在肝臟的基因編輯與基因治療研究領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)范疇中病毒載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組腺相關(guān)病毒載體及其臨床應(yīng)用前景。

背景技術(shù)

我國是肝臟疾病的高發(fā)地區(qū)，肝癌更是危害我國國民健康的主要惡性腫瘤之一，迄今沒有理想的根治藥物。而隨著生物醫(yī)學(xué)科技的飛速發(fā)展，基因編輯與基因療法有望成為人類戰(zhàn)勝各類疾病的新技術(shù)之一。重組腺相關(guān)病毒(rAAV)作為常用的遞送外源目的基因的載體之一，具有穩(wěn)定性高、致病性低、免疫原性低、宿主范圍廣，能夠介導(dǎo)外源基因長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因此被視為最有發(fā)展前景的基因治療載體之一。但由于AAV的主要細(xì)胞受體硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的廣泛分布于各種細(xì)胞的細(xì)胞膜上，所以天然血清型的AAV不具有特定組織和器官的靶向性。因此，研究人員嘗試通過多種手段以期賦予AAV新的靶向性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有基因編輯與基因治療技術(shù)的不足之處，提供了HBVPreS1多肽修飾的人肝細(xì)胞特異靶向性的rAAV2載體及其制備方法和用途。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：

一種HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體，其特征在于：在所述HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體的氨基酸序列中含有PreS1多肽序列，所述PreS1多肽序列選自：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQID No.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQID No.8所示的PreS1-6。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是：

一種編碼HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體的核酸分子，所述核酸分子的序列為：在pAAV-H22質(zhì)粒的587號位點(diǎn)插入有編碼PreS1多肽的基因序列；所述PreS1多肽選自：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的PreS1-6。

在一個(gè)具體的實(shí)施例中：編碼所述PreS1-1的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQID No.9所示的上游引物和如SEQ ID No.10所示的下游引物，編碼所述PreS1-2的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.11所示的上游引物和如SEQ ID No.12所示的下游引物，編碼所述PreS1-3的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.13所示的上游引物和如SEQ ID No.14所示的下游引物，編碼所述PreS1-4的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQID No.15所示的上游引物和如SEQ ID No.16所示的下游引物，編碼所述PreS1-6的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.19所示的上游引物和如SEQ ID No.20所示的下游引物。

上述的HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體例如可通過上述的核酸分子編碼得到。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是：

一種HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體的制備方法，包括：

1)病毒包裝質(zhì)粒的改造：通過同源重組法，將所述PreS1多肽序列對應(yīng)的基因序列插入到pAAV-H22質(zhì)粒的587號位點(diǎn)處，獲得改造質(zhì)粒，該改造質(zhì)粒將作為后續(xù)改造病毒載體包裝所需的實(shí)驗(yàn)材料；