[發(fā)明專利]HBV PreS1多肽修飾的人肝細胞特異靶向性的rAAV2載體及其制備方法和用途在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110055844.6 | 申請日： | 2021-01-15 |
| 公開（公告）號： | CN112852879A | 公開（公告）日： | 2021-05-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 許瑞安;劉艷君;崔秀靈 | 申請（專利權(quán)）人： | 華僑大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/864 | 分類號： | C12N15/864;A61K48/00;A61P1/16;A61P35/00 |
| 代理公司： | 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204 | 代理人： | 張松亭;秦彥蘇 |
| 地址： | 362000 福建省*** | 國省代碼： | 福建;35 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | hbv pres1 多肽 修飾 肝細胞 特異 靶向 raav2 載體 及其 制備 方法 用途 | ||
1.一種HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體，其特征在于：在所述HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體的氨基酸序列中含有PreS1多肽序列，所述PreS1多肽序列選自：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQID No.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQID No.8所示的PreS1-6。
2.一種編碼HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的序列為：在pAAV-H22質(zhì)粒的587號位點插入有編碼PreS1多肽的基因序列；所述PreS1多肽選自：氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PreS1-1、氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的PreS1-2、氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的PreS1-3、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的PreS1-4、或氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的PreS1-6。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于：編碼所述PreS1-1的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.9所示的上游引物和如SEQ ID No.10所示的下游引物，編碼所述PreS1-2的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.11所示的上游引物和如SEQ IDNo.12所示的下游引物，編碼所述PreS1-3的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.13所示的上游引物和如SEQ ID No.14所示的下游引物，編碼所述PreS1-4的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.15所示的上游引物和如SEQ ID No.16所示的下游引物，編碼所述PreS1-6的基因序列的相應(yīng)的引物對包括如SEQ ID No.19所示的上游引物和如SEQ IDNo.20所示的下游引物。
4.一種權(quán)利要求1所述的HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體的制備方法，其特征在于：包括：
1)通過同源重組法，將所述PreS1多肽序列對應(yīng)的基因序列插入到pAAV-H22質(zhì)粒的587號位點處，獲得改造質(zhì)粒；
2)將改造質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞并進行病毒的包裝，包裝完成后對病毒載體進行純化，得到改造病毒載體，即為所述的HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟1)包括：將pAAV-H22質(zhì)粒與pUCm-T質(zhì)粒雙酶切后，回收2749bp和2705bp的片段，進行酶連，構(gòu)成工作質(zhì)粒，該工作質(zhì)粒含有pAAV-H22質(zhì)粒上的587號改造位點；隨后對所述工作質(zhì)粒的587號位點進行線性化，再將所述PreS1多肽序列對應(yīng)的基因序列插入到587號位點處，再對插入了基因序列的587號位點片段進行酶切，重新連回pAAV-H22質(zhì)粒上，獲得改造質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述線性化采用的引物對包括如SEQID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述步驟2)中，通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法將改造質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞；采用的質(zhì)粒包括pFd6、pAAV-eGFP和改造質(zhì)粒；所述宿主細胞為HEK293。
8.一種權(quán)利要求1所述的HBV PreS1多肽修飾的rAAV2載體在制備治療肝臟疾病的藥物中的用途。
9.一種權(quán)利要求2或3所述的核酸分子在制備治療肝臟疾病的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的用途，其特征在于：所述肝臟疾病包括肝癌。
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