[發明專利]一種從雙子葉植物根及下胚軸中分離維管束的方法

有效

• 申請號: 202110055550.3
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112900126B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 梁大成;吳輝艷;鄧竹英;李冬怡
• 申請（專利權）人: 長江大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;D21B1/30;D21C5/00
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 陳建軍

本發明公開了一種從雙子葉植物根及下胚軸中分離維管束的方法，所述方法包括：植株培養、固定、維管束剝離、纖維素酶和果膠酶消化以及用Triton X?100剔除雜質污染。本發明通過在固定步驟中利用茶皂素協助維管束與鄰近組織分離，然后用纖維素酶和果膠酶進行聯合消化處理，有效去除了維管及鄰近組織中的細胞壁、胞間殘留物、纖維組織及膜樣物質殘留等，進一步利用Triton X?100洗脫維管束周圍組織，有效剔除膜樣軟組織的粘連污染，從而將維管束從根及下胚軸中分離出來，采用該方法分離得到的維管束，在顯微鏡下可觀察到清晰的形態結構，無雜質影響，該方法簡單快速易實施，分離效果好，可用于維管束形成和發育的研究。

技術領域

本發明屬于維管束分離技術領域，具體涉及一種從雙子葉植物根及下胚軸中分離維管束的方法。

背景技術

維管束是維管植物的輸導系統，在植物體內常呈束狀結構，貫穿在植物體的各種器官內。主要分為韌皮部和木質部,韌皮部包括篩管和伴胞，主要負責同化物的運輸；木質部以導管為主，負責輸送水分和無機鹽類。維管束除了具有運輸作用外，還對植物器官起著機械支撐作用。

一直以來，對于維管束的形成和發育研究受到學界的廣泛重視，現有技術中一般借助顯微與超顯微技術就植物某些部位的發生、發育和結構進行多維度探索，然而目前已知的可觀察到高清晰維管束形態結構的顯微技術一直沒有出現，其主要原因是現有技術中缺乏維管束完全分離技術，進而限制了對維管束形態發育的深入研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從雙子葉植物根及下胚軸中分離維管束的方法，具體為：將植物的根及下胚軸浸泡潤洗固定后，在顯微鏡下將維管束與相鄰組織分開，并將解剖后的材料用纖維素酶和果膠酶進行聯合消化處理，并進一步利用Triton X-100洗脫維管束周圍的膜樣軟組織，從而實現維管束的分離，采用該方法分離得到的維管束，在顯微鏡下可觀察到清晰的形態結構。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種從雙子葉植物根及下胚軸中分離維管束的方法，包括以下步驟：

P1：選取植物種子，經表面消毒后播種至培養基并培養；

P2：選取P1中生長健壯的完整植株，去除葉片，留取根和下胚軸，置于離心管中；

P3：向P2的離心管中加入含有體積分數0.1％茶皂素的PEM緩沖液，浸泡30-40分鐘，然后用PEM緩沖液潤洗，將潤洗后的材料在含體積分數4％多聚甲醛的PBS緩沖液中固定30-40分鐘，然后再次用PEM緩沖液沖洗；該步驟在PEM緩沖液中加有茶皂素，茶皂素能快速浸潤到根及下胚軸組織，以降低維管束與鄰近組織間的連接，因此便于維管束的剝離。

P4：在解剖顯微鏡下，用解剖針將維管束與其相鄰組織分開，并將維管束取出，放入裝有PEM緩沖液的離心管中；利用解剖針進行分離得到的解剖材料，其中不僅含有維管束，還含有維管束鞘細胞殘留壁、纖維組織、膜樣物質等多種細胞或胞間殘留物，因此無法直接用于觀察維管束的形態結構。

P5：取P4中解剖后的材料，放入含有纖維素酶和果膠酶的酶液中，于28℃消化處理；該步驟中利用纖維素酶和果膠酶進行聯合消化處理，可有效去除解剖材料中的殘留細胞壁、胞間殘留物、纖維組織及部分膜樣物質等。

P6：將P5中消化完全的材料放入Triton X-100中清洗15-20分鐘，然后用PEM緩沖液沖洗，沖洗完畢后即完成對植物根及下胚軸中維管束的分離。該步驟中進一步采用Triton X-100對維管束進行清洗，以去除維管束周圍的組織，有效剔除膜樣軟組織的粘連污染。

進一步的，在步驟P5中，所述酶液的組分包括：5mM MES緩沖液，0.5％(w/v)纖維素酶，0.2％(w/v)果膠酶，0.12M蔗糖和1mM CaCl₂，并調節pH為5.5。