[發明專利]一種從雙子葉植物根及下胚軸中分離維管束的方法

有效

• 申請號: 202110055550.3
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112900126B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 梁大成;吳輝艷;鄧竹英;李冬怡
• 申請（專利權）人: 長江大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;D21B1/30;D21C5/00
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 陳建軍

1.一種從雙子葉植物根及下胚軸中分離維管束的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

P1：選取植物種子，經表面消毒后播種至培養基并培養；

P2：選取P1中生長健壯的完整植株，去除葉片，留取根和下胚軸，置于離心管中；

P3：向P2的離心管中加入含有體積分數0.1％茶皂素的PEM緩沖液，浸泡30-40分鐘，然后用PEM緩沖液潤洗，將潤洗后的材料在含體積分數4％多聚甲醛的PBS緩沖液中固定30-40分鐘，然后再次用PEM緩沖液沖洗；

P4：在解剖顯微鏡下，用解剖針將維管束與其相鄰組織分開，并將維管束取出，放入裝有PEM緩沖液的離心管中；

P5：取P4中解剖后的材料，放入含有纖維素酶和果膠酶的酶液中，于28℃消化處理；

P6：將P5中消化完全的材料放入Triton X-100中清洗15-20分鐘，然后用PEM緩沖液沖洗，沖洗完畢后即完成對植物根及下胚軸中維管束的分離。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟P5中，所述酶液的組分包括：5mMMES緩沖液，0.5％(w/v)纖維素酶，0.2％(w/v)果膠酶，0.12M蔗糖和1mM CaCl₂，并調節pH為5.5。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PEM緩沖液包括：50mM PIPES、5mMEGTA、2.5mM MgSO₄，并調節pH為6.9。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟P1中，在通風櫥內用氯氣對植物種子進行表面消毒。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟P1中，將表面消毒后的種子播種至MS培養基上，在16h光照/8h黑暗，22-23℃條件下培養7-30天。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟P3具體為：向P2的離心管中加入20mL含有體積分數0.1％茶皂素的PEM緩沖液，浸泡30-40分鐘，然后用PEM緩沖液潤洗3次，每次20分鐘，將潤洗后的材料在含體積分數4％多聚甲醛的PBS緩沖液中，于-20℃真空干燥條件下固定30-40分鐘，然后再次用PEM緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，重復步驟P4，以獲得多個解剖后的材料，且解剖后的材料數量不超過6個。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟P5的消化處理過程中，隨時鏡檢，直至觀察到維管束上殘留的組織消化完全。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟P6中所述Triton X-100的濃度為5％。