[發明專利]一種基于腸道微生物的昆蟲地理溯源方法

在審

• 申請號: 202110055453.4
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112725479A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 師科
• 申請（專利權）人: 檢科智創（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/10;C12Q1/06;C12Q1/04;C12R1/145;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

本發明涉及一種基于腸道微生物的昆蟲地理溯源方法。本發明利用宏基因組采樣測序技術，對昆蟲基因組16SDNA高變區進行高通量測序，對不同地理來源昆蟲的腸道微生物進行聚類分析，判定不同昆蟲可以依據微生物門水平的差異進行區分，不同地理來源的同種昆蟲可以依據微生物屬水平的差異進行區分，從而當調查或監測發現可能的有害昆蟲時，可以利用其腸道微生物的多樣性判定昆蟲入侵來源地，準確區分不同地理來源的昆蟲。

技術領域

本發明涉及昆蟲地理溯源和高通量測序技術領域，具體涉及一種基于腸道微生物的昆蟲地理溯源方法。

背景技術

目前用于地理溯源方面的研究技術主要有DNA條形碼技術、限制性片段長度多態性技術(restriction fragment length polymorphism， RFLP)、單核苷酸多態性技術(single nucleotide polymorphism,SNP)、微衛星標記等，這些技術雖然能夠突破形態學方法，對入侵昆蟲的分類地位、入侵來源、擴散途徑等提供強有力的技術手段，但是這些技術都是通過基因水平的差異研究昆蟲的遺傳進化，從而推測其來源地；很多昆蟲存在雜交、隱存種或復合種等基因復雜的類群，很難通過基因變化推測其入侵來源地。

基因相關的技術方法需要經歷多代才有可能找到差異基因用于溯源，而昆蟲的腸道微生物幾天或幾個月就有變化，昆蟲腸道微生物多樣性研究能夠反應出較短時間內的地理環境變化。當調查或監測新發現可能的有害昆蟲時，可以利用其腸道微生物的多樣性判定昆蟲來源地。隨著測序技術的更新換代，如果能夠利用高通量測序技術通過檢測昆蟲腸道微生物的多樣性，進而反映出昆蟲地理來源，則將會極大且更為客觀地反映昆蟲的實際來源地。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于腸道微生物的昆蟲地理溯源方法。

本發明提供的一種基于腸道微生物的昆蟲地理溯源方法，是將 16SrDNA測序技術應用于昆蟲腸道微生物的測序中，通過提取包含昆蟲腸道的整個昆蟲蟲體基因組DNA，針對16SrDNA進行PCR擴增，對16SrDNA片段進行高通量測序，測序結果對每個樣本的微生物做出包括門、綱、目、科、屬、種信息的精細分類，并獲得每類豐度值，對每個樣本微生物種類、豐度做差異性分析，根據分析結果確定待測樣本昆蟲的來源地。依據微生物門水平的差異對來自不同地理位置的不同昆蟲進行區分；依據微生物屬水平的差異對不同地理來源的同種昆蟲進行區分。

本發明提供的昆蟲地理溯源方法，在提取昆蟲基因組DNA前，需先對昆蟲樣品進行預處理，方法為：

(1)取待測昆蟲的腹部或整個昆蟲放入容器中，向容器中加入玻璃珠和緩沖液；將容器置于破碎儀上破碎45-90秒；

(2)再在85-95℃的條件下混勻孵育；

(3)再將容器置于破碎儀上破碎90-150秒；離心后取上清液；用于后續試劑盒提取昆蟲及其腸道微生物的基因組DNA。

本發明的昆蟲地理溯源方法中，步驟(1)中所述玻璃珠的直徑為0.05-0.15mm；玻璃珠與同一容器中昆蟲總質量的質量比為(1-3)： 0.5；所述緩沖液為l Inhibit EXBuffer；將容器置于破碎儀上破碎1min。

步驟(2)中，是將步驟(1)中破碎儀處理后的含昆蟲樣本和玻璃珠的容器放置于恒溫混勻儀中，95℃，900rpm，孵育8-12min，優選10min。

本發明在實踐中注意到，不同昆蟲體表的表皮厚薄不一致，常規的基因組提取方法對不同的昆蟲采用相同的方法提取基因組DNA，若不統一對待提取DNA的昆蟲進行前處理，會極大影響提取效率。本發明經過反復研究和評估后，發現在提取基因組DNA前，對昆蟲進行前處理，添加玻璃珠，對于昆蟲組織破碎很有幫助，提升了DNA 提取效率的同時，也使提取方法統一化。

本發明經過長期研究還發現，昆蟲蟲體大小影響基因組DNA提取濃度，為了減少該影響，對不同蟲體大小做了分類，以確保樣本的統一性；