[發明專利]一種基于腸道微生物的昆蟲地理溯源方法

在審

• 申請號: 202110055453.4
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112725479A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 師科
• 申請（專利權）人: 檢科智創（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6869;C12Q1/10;C12Q1/06;C12Q1/04;C12R1/145;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 陳征

1.一種基于腸道微生物的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，提取包含昆蟲腸道的整個昆蟲蟲體基因組DNA，針對16SrDNA進行PCR擴增，對16SrDNA片段進行高通量測序，測序結果對每個樣本中的微生物進行精細分類，包括門、綱、目、科、屬、種信息，并獲得每類豐度值，對每個樣本微生物種類、豐度做差異性分析，依據微生物門水平的差異對來自不同地理位置的不同昆蟲進行區分，依據微生物屬水平的差異對不同地理來源的同種昆蟲進行區分。

2.根據權利要求1所述的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，提取昆蟲基因組DNA前，需先對昆蟲樣品進行預處理，方法為：

(1)取待測昆蟲的腹部或整個昆蟲放入容器中，向容器中加入玻璃珠和緩沖液；將容器置于破碎儀上破碎45-90秒；

(2)再在85-95℃的條件下混勻孵育；

(3)再將容器置于破碎儀上破碎90-150秒；離心后取上清液；用于后續試劑盒提取昆蟲及其腸道微生物的基因組DNA。

3.根據權利要求2所述的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，步驟(1)中所述玻璃珠的直徑為0.05-0.15mm；玻璃珠與同一容器中昆蟲總質量的質量比為(1-3)：0.5；所述緩沖液為lInhibit EX Buffer；將容器置于破碎儀上破碎1min。

4.根據權利要求2或3所述的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，步驟(2)中，是將步驟(1)中破碎儀處理后的含昆蟲樣本和玻璃珠的容器放置于恒溫混勻儀中，95℃，900rpm，孵育8-12min，優選10min。

5.根據權利要求1-4任一所述的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，昆蟲蟲體大小影響基因組DNA提取濃度，為了減少該影響，對不同蟲體大小做了分類，以確保樣本的統一性；

若昆蟲體長5mm以上，容器中放入一頭待測昆蟲，作為一個樣本，3-5次樣本重復；

若昆蟲體長2-5mm之間，容器中放入3-6頭待測昆蟲，且待測昆蟲均采自同一地點，作為一個樣本，3-5次樣本重復；

若昆蟲體長小于2mm，容器中放入8-13頭待測昆蟲，且待測昆蟲均采自同一地點，作為一個樣本，3-5次樣本重復。

6.根據權利要求1-5任一所述的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，針對16SrDNA進行PCR擴增的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。

7.根據權利要求6所述的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，針對16SrDNA進行兩次PCR擴增，第一次以提取的基因組DNA為模板進行PCR擴增，第二次以第一次擴增純化后的產物為模板進行第二次PCR擴增，兩次PCR擴增所用的引物序列相同，僅第二次PCR擴增用的引物帶有用于分辨樣本用的index序列信息。

8.根據權利要求6所述的昆蟲地理溯源方法，其特征在于，

若針對單頭昆蟲樣本的DNA體系進行第一次PCR擴增，則PCR反應條件為：95℃ 5min；98℃ 20s，52℃ 30s，72℃ 30s，20個循環；72℃ 5min；4℃；

若針對3-6頭昆蟲樣本構成的DNA體系進行第一次PCR擴增，則PCR反應條件為：95℃5min；98℃ 20s，52℃ 30s，72℃ 30s，25個循環；72℃ 5min；4℃；

若針對8-13頭昆蟲樣本構成的DNA體系進行第一次PCR擴增，則PCR反應條件為：95℃5min；98℃ 20s，52℃ 30s，72℃ 30s，25個循環；72℃ 5min；4℃。

9.一種昆蟲腸道微生物數據庫，其特征在于：所述數據庫的構建方法包括以下步驟：

(1)提取已知來源地的每個昆蟲樣本中整個昆蟲蟲體的基因組DNA，無需解剖昆蟲腸道；(2)PCR擴增獲得16SrDNA片段，對16SrDNA片段進行高通量測序；(3)測序數據分析每個樣本中的微生物種類，包括門、綱、目、科、屬、種信息，并獲得每類豐度值，標記每個來源地的每個樣本微生物的種類和豐度值。

10.權利要求9所述的昆蟲腸道微生物數據庫在昆蟲地理溯源中的應用，其特征在于，采用權利要求1-8任一所述的昆蟲地理溯源方法，得到待測昆蟲腸道微生物的16SrDNA片段測序數據，將該數據與權利要求9所述的昆蟲腸道微生物數據庫進行比對，判斷其地理來源。