[發明專利]與大豆苗期/成株期抗旱性相關的SNP分子標記及其應用

在審

• 申請號: 202110053061.4
• 申請日: 2021-01-15
• 公開（公告）號: CN112725498A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張彥軍;王興榮;李玥;李永生;茍作旺;祁旭升
• 申請（專利權）人: 甘肅省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 蘭州錦知源專利代理事務所(普通合伙) 62204
• 代理人: 勾昌羽

1.與大豆苗期/成株期抗旱性相關的SNP分子標記，其特征在于，所述分子標記來自Glyma.07g094200基因；所述SNP分子標記的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.用于檢測權利要求1所述與大豆苗期/成株期抗旱性相關的SNP分子標記的特異性引物，其特征在于，

所述檢測與大豆苗期抗旱性相關的SNP分子標記的特異性引物，包括：正向引物，如序列表中SEQ ID NO.2所示；反向引物，如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述檢測與大豆成株期抗旱性相關的SNP分子標記的特異性引物，包括：正向引物，如序列表中SEQ ID NO.4所示；反向引物，如序列表中SEQ ID NO.5所示。

3.根據權利要求1所述的SNP分子標記在檢測大豆苗期/成株期抗旱性中的應用。

4.根據權利要求2所述的特異性引物在檢測大豆苗期/成株期抗旱性中的應用。

5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述檢測大豆苗期抗旱性的方法，包括以下步驟：

1）利用CTAB法提取待鑒定大豆種質的全基因組DNA；

2） 以待鑒定大豆種質的全基因組DNA為模板，利用權利要求2所述的特異性引物SEQID NO.2和SEQ ID NO.3進行PCR擴增，獲得擴增產物片段；

3）利用Acil限制性內切酶對PCR擴增產物進行酶切；

4）將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，其中電泳條帶顯示173bp的為苗期抗旱種質，電泳條帶顯示149bp和24bp的為苗期敏旱種質。

6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述檢測大豆成株期抗旱性的方法，包括以下步驟：

1）利用CTAB法提取待鑒定大豆種質的全基因組DNA；

2） 以待鑒定大豆種質的全基因組DNA為模板，利用權利要求2所述的特異性引物SEQID NO.4和SEQ ID NO.5進行PCR擴增，獲得擴增產物片段；

3）將PCR產物進行一代測序，基因Glyma.07g094200的物理位置在8796932bp處為“G”等位基因的為成株期抗旱種質，“T”等位基因的為成株期敏旱種質。

7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于，所述步驟1）中，DNA的提取步驟包括：

a） 取大豆新鮮葉片加入液氮研磨成粉末狀，取適量放入2.0 mL離心管中；

b） 加入800 μL 預熱后的CTAB提取液，渦旋混勻，65℃水浴30 min，每10 min搖晃一次；

c） 水浴后加入800 μL 三氯甲烷：異戊醇為24:1的混合液，輕輕顛倒混勻；

d） 12000r離心20 min，吸取上清液500 μL 至1.5 mL離心管中，加入500 μL冰凍異戊醇，輕輕顛倒至沉淀出現；

e） 12000r離心15 min，倒掉上清液；

f） 用70%酒精中洗滌兩次，晾干后溶于100 μL TE緩沖液中；

g） 取2μL溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量，-20℃中保存備用。

8.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于，所述步驟2）中，PCR反應的擴增體系為：總體積為20 μL, 2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL，10μM的正向引物1μL，10μM的反向引物1μL，20-50 ng/μL的DNA 1 μL，ddH₂O 7 μL；PCR反應的條件為：95℃預變性5 min；95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s；循環34次；72℃終延伸5 min。

9.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述步驟3）中，酶切體系為：總體積為10 μL, 限制性內切酶 1 μL，10×NEBuffer 1 μL，PCR產物 5 μL，ddH₂O 3 μL；酶切反應的條件為：37℃酶切30 min。